南京农大动物医学院/江苏省农科院兽医所宋艳华, 王芳等:基于RdRp蛋白的兔出血症病毒感染与免疫鉴别诊断ELISA方法的建立

《畜牧兽医学报》2026年第57卷第1期刊登了南京农业大学动物医学院等单位朱薇, 仇汝龙, 陈萌萌, 胡波, 魏后军, 范志宇, 葛雷, 伍孟婷, 宋艳华, 王芳的文章——“基于RdRp蛋白的兔出血症病毒感染与免疫鉴别诊断ELISA方法的建立”，该文由现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-43-C-1)资助。该研究的创新点:首次利用兔出血症病毒（RHDV）非结构蛋白RdRp建立鉴别诊断ELISA方法，实现基因工程疫苗免疫与病毒感染的区分；发现RdRp蛋白在RHDV1和RHDV2间高度保守，且感染后产生特异性抗体而疫苗免疫不产生，为兔出血症临床监测和流行病学调查提供新工具。

研究背景与目的

兔出血症病毒（RHDV）是引起兔急性、烈性、高度致死性传染病的病原，分为RHDV1和RHDV2两种基因型。目前使用的VP60基因工程疫苗与病毒感染均能产生抗VP60抗体，无法区分疫苗免疫和病毒感染。RdRp蛋白是RHDV的非结构蛋白，在病毒感染和复制中发挥重要作用，但关于宿主对RdRp的免疫应答尚未研究。本研究旨在表达纯化RdRp蛋白，建立检测抗RdRp血清抗体的间接ELISA方法，为区分RHDV基因工程疫苗免疫和病毒感染提供鉴别诊断工具。

1 材料与方法

1.1 试验材料

TB1感受态细胞、pMal-c6T原核表达载体、RHDV标准阳性血清（RHDV1-NJ2009株攻毒后血清）、阴性血清（SPF级兔血清）、抗RdRp蛋白高免兔阳性血清、RHDV1攻毒后14和28d血清样本、RHDV2 VP60基因工程疫苗免疫14 d血清样本26份、纯化的RHDV1和RHDV2 VP60蛋白。

1.2 主要试剂

增强型ECL化学发光检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速试剂盒、Marker、MBP直链淀粉树脂、Ni Resin。

1.3 RdRp序列的同源性分析

使用DNAStar软件中的MegAlign分析软件，采用Clustal W法对18株兔病毒属分离株的RdRp氨基酸序列进行同源性分析。

1.4 重组RdRp蛋白的原核表达及纯化

基于RHDV-NJ2009株和RHDV2-SC2020株RdRp基因序列，构建重组质粒pMal-c6T-RHDV1-RdRp和pMal-c6T-RHDV2-RdRp，转化TB1感受态细胞，IPTG诱导表达，直链淀粉树脂亲和层析纯化。

1.5 重组蛋白的酶切、纯化与鉴定

使用TEV酶切除MBP标签，镍柱纯化获得RdRp蛋白；Western blot验证RHDV1和RHDV2感染血清与两种RdRp蛋白的交叉反应性。

1.6 间接ELISA方法的建立与条件优化

以RdRp蛋白为包被抗原，棋盘滴定法优化包被浓度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg·mL⁻¹）和血清稀释度（1∶50~1∶400）；优化封闭剂、血清作用时间、酶标抗体稀释度、TMB显色时间等条件。

1.7 间接ELISA的临界值确定

对40份RHDV阴性样本进行检测，计算平均值X和标准差SD，以X+3SD作为临界值判定标准。

1.8 特异性试验

用建立的ELISA方法检测兔多杀性巴氏杆菌、兔出血症病毒、兔肠炎沙门菌和兔轮状病毒的阳性血清，评估方法特异性。

1.9 敏感性试验

将标准阳性参考血清倍比稀释（1∶100~1∶12800），同时进行Western blot对比，评价方法敏感性。

1.10 重复性试验

相同批次和不同批次包被的酶标板分别检测3份阳性和3份阴性血清，每份样品3个重复孔，计算批内和批间变异系数。

1.11 RHDV RdRp蛋白的免疫反应性分析

以VP60和RdRp蛋白为包被抗原，检测RHDV1感染后14、28d血清和RHDV2 VP60基因工程疫苗免疫后14d血清，分析疫苗免疫及病毒感染后的抗体应答差异。

2 结果

2.1 RHDV-RdRp氨基酸序列的同源性分析结果

GI.1型毒株间RdRp同源率97.3%~99.0%，GI.2型间97.5%~99.8%，GI.1与GI.2型间96.9%~97.5%，表明RdRp蛋白在不同基因型间具有较好保守性。

2.2 RdRp蛋白的表达、纯化与酶切鉴定

重组蛋白RHDV1-RdRp和RHDV2-RdRp成功表达并纯化，分子量约103 ku；酶切后分子量约57 ku，与预期一致。Western blot显示两种RdRp蛋白均与RHDV1或RHDV2感染血清发生特异性反应，无型别间差异（图1、2）。选择RHDV2-RdRp建立ELISA方法。

2.3 ELISA反应条件优化结果

最佳条件：RHDV2-RdRp包被浓度2.5 μg·mL⁻¹，血清稀释度1∶100，5%脱脂乳封闭2h，血清37 °C孵育60 min，酶标抗体1∶10 000稀释作用30 min，TMB室温显色15 min。

2.4 临界值的确定

40份阴性血清平均值0.121 8，标准差0.034 3，临界值X+3SD=0.225。待检样品OD_{450 nm}≥0.225判定阳性，<0.225判定阴性（表1）。

2.5 特异性鉴定结果

除RHDV感染血清为阳性外，兔多杀性巴氏杆菌、兔肠炎沙门菌和兔轮状病毒阳性血清均为阴性，方法特异性良好。

2.6 敏感性试验结果

ELISA检测阳性血清稀释至1∶6 400仍为阳性，与Western blot结果一致，方法敏感性良好（图3）。

2.7 重复性试验结果

批内变异系数2.09%~7.16%，批间变异系数2.07%~7.72%，均小于10%，方法稳定性良好。

2.8 RHDV RdRp蛋白的免疫反应性分析

RHDV1攻毒后14和28d可检测到抗RdRp蛋白IgG抗体，效价分别为1∶400和1∶1 600；26份RHDV2 VP60基因工程疫苗免疫后血清抗RdRp检测均为阴性（图4、5）。表明RHDV感染可诱导抗RdRp抗体产生，而VP60基因工程疫苗免疫不产生。

3 讨论

RHDV VP60蛋白是保护性抗原，疫苗免疫和病毒感染均能产生抗VP60抗体，无法区分免疫与感染状态。本研究首次针对RHDV非结构蛋白RdRp建立ELISA检测方法，发现RdRp蛋白在RHDV1和RHDV2间高度保守（同源率>96.9%），且两种蛋白与不同型别感染血清均能特异性反应。

关键发现是RHDV感染后机体产生抗RdRp抗体，而VP60基因工程疫苗免疫后不产生该抗体。这一差异为区分疫苗免疫和病毒感染提供了分子基础。建立的ELISA方法特异性好、敏感性高（检测限1∶6 400）、重复性好（CV<10%），可用于临床监测RHDV感染，特别适用于评估疫苗免疫后的野毒感染情况。

由于RHDV2对所有年龄段兔均易感且致死率高，本研究选用RHDV2-RdRp作为包被抗原，兼顾了当前RHDV2广泛流行的趋势。该方法为RHDV流行病学调查、疫苗免疫效果评价和临床感染筛查提供了有效工具。

4 结论

本研究成功表达纯化可溶性RdRp蛋白并建立ELISA检测方法，该方法可用于检测不同基因型RdRp蛋白的抗体应答，能够区分RHDV基因工程疫苗免疫和病毒感染，为RHDV-RdRp蛋白的抗体应答规律研究及疫苗免疫后的临床感染筛查提供了有效方法。