IF：6.2

DOI号:10.1021/acs.jafc.5c06410

1. SY暴露加重DSS诱导的小鼠结肠炎

为探究日落黄（SY）对结肠炎发展的影响，研究者对C57BL/6小鼠在整个实验期间持续饮用含SY（0.1 mg/mL）或不含SY的饮用水，并于最后一周给予2% DSS处理（图1A）。DSS组小鼠出现体重下降（P< 0.001），SY暴露组体重减轻更为显著（P< 0.001，图1B）。与单纯DSS组相比，SY+DSS组疾病活动指数（DAI）升高（P< 0.01），结肠长度显著缩短（P< 0.05，图1C、D）。组织学检查显示，SY+DSS组隐窝结构破坏加重，黏膜及黏膜下层免疫细胞浸润范围扩大，病理评分显著高于DSS组（P< 0.05，图1E）。此外，SY暴露显著抑制DSS结肠炎小鼠Muc2及ZO-1表达，进一步损害肠道黏液屏障（P< 0.05，图1F、G）。SY+DSS组结肠IL-1β和TNF-α水平显著升高（P< 0.01，图1H、I），且IL-1β、TNF-α表达均高于DSS组（P< 0.05，图1J、K），同时Muc2表达降低（P< 0.05，图1L）。

图1 SY暴露增加结肠炎易感性。(A) 实验设计示意图（n = 10）。(B) 体重变化以初始体重的均值变化表示。(C) 疾病活动指数（DAI）。(D) 结肠长度。(E) 结肠代表性HE染色及病理评分（n = 5），比例尺：100 μm。远端结肠组织免疫组化染色及平均光密度：（F）Muc2、（G）ZO-1，比例尺：100 μm（n = 5）。结肠组织中（H）IL-1β与（I）TNF-α水平。结肠组织中（J）IL-1β、（K）TNF-α及（L）MUC-2的mRNA表达（n = 10）。数据以均值±标准误表示，采用双因素方差分析结合Tukey多重比较。^*P< 0.05，^**P< 0.01，^***P< 0.001 vs 对照组；#P< 0.05，##P< 0.01 vs 组内比较。

2. SY 改变肠道菌群结构并降低嗜黏蛋白阿克曼菌（AKK）丰度

随后，研究者探究肠道菌群是否介导SY 暴露加剧 C57BL/6 小鼠结肠炎易感性。与对照（Con）组相比，DSS 组（图 2A）与 SY 组（图 2B）的肠道健康指数（GMHI）均显著下降（P< 0.001），且 DSS+SY 组进一步降低（P< 0.001，图 2C）。同时，DSS 与 DSS+SY 组的微生物失调指数（MDI）显著升高（P< 0.001，图 2D），提示 SY 暴露负面影响了 UC 小鼠的肠道健康。尽管个体间差异显著，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示四组粪便菌群明显分离（图 2E），表明菌群组成具有组间特异性。LEfSe 差异分析（图 2F、G）表明，SY 显著影响疣微菌门（Verrucomicrobia）、阿克曼菌科（Akkermansiaceae）及阿克曼菌属（Akkermansia）。值得注意的是，SY 组与 DSS 组中 AKK的相对丰度均显著低于对照组（图2H、I）；DSS+SY 组肠杆菌属（Enterobacter）比例亦高于单纯 DSS 组（图 2J）。

图2 日落黄暴露诱导肠道菌群组成与功能改变。(A) 正常小鼠经DSS处理后及(B) SY处理后肠道菌群健康指数（n=10）。(C) SY暴露的结肠炎小鼠肠道菌群健康指数。(D) 四组间微生物失调指数比较。(E) 基于OTU的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）得分图。(F) LEfSe分析分支图展示肠道菌群群落结构。(G) 线性判别分析（LDA）显示各组在属水平显著富集的差异菌群。(H) 对照组与DSS组间属水平差异菌比较；SY暴露后(I)正常状态及(J)结肠炎小鼠属水平差异菌比较。数据以均值±标准误表示，采用Wilcoxon秩和检验分析；^***P< 0.001 vs 对照组。

3. 肠道菌群介导日落黄暴露对小鼠结肠炎的加剧作用

菌群组成及代谢的改变已被证实可调控结肠炎易感性。因此，研究者推测日落黄（SY）诱导的肠道菌群失衡及其活性变化使SY处理小鼠更易患结肠炎。为验证肠道菌群的作用，开展了粪便菌群移植（FMT）实验（图3A）。与接受对照菌群（FMT-C）的小鼠相比，接受SY暴露供体菌群（FMT-SY）的小鼠结肠炎程度显著加重，表现为体重明显下降（P< 0.05）、疾病活动指数升高（P< 0.05）及结肠长度缩短（P< 0.05）（图3B–D）。组织学检查显示，FMT-SY组炎症细胞浸润增多、隐窝结构破坏加剧，病理评分显著升高（P< 0.05，图3E、F）。免疫组化染色表明，FMT-SY组Muc2表达较FMT-C组显著降低（P< 0.01，图3G、H）。FMT-SY组结肠组织IL-1β（P< 0.05）和TNF-α（P< 0.01）水平显著高于FMT-C组（图3I、J）。qPCR结果显示，FMT-SY组结肠IL-1β和TNF-αmRNA表达上调，而Muc2、Occludin及ZO-1 mRNA表达显著下调（P< 0.001，图3K）。蛋白水平亦证实，FMT-SY组Occludin和ZO-1表达降低，提示肠道屏障功能受损（图3L、M）。

图3 肠道菌群介导日落黄处理小鼠结肠炎的加剧效应。(A) 实验设计示意图（n = 10）。(B) 体重变化：以初始体重为基线的体重改变。(C) 疾病活动指数。(D) 结肠长度。(E) 结肠代表性 HE 染色及 (F) 病理评分（n = 5），比例尺：100 μm。(G) 远端结肠 Muc2 免疫组化染色及 (H) 平均光密度，比例尺：100 μm。(I) 结肠组织 IL-1β 与 (J) TNF-α 含量。(K) 结肠组织中 IL-1β、TNF-α、MUC-2、Occludin及ZO-1的mRNA 表达水平。(L) Occludin、ZO-1 与 GAPDH 的 Western blot 代表性条带及 (M) 相对定量结果。数据以均值 ± 标准误表示，采用非配对双尾 t 检验进行分析；^*P< 0.05，^**P< 0.01，^***P< 0.001 与对照组比较。

4. SY 暴露扰乱谷胱甘肽代谢

为阐明SY 暴露对相关分子机制的影响，研究者开展了血清代谢组学分析。PLS-DA 结果显示，无论是否给予 DSS 处理，小鼠血清代谢谱均出现显著分离（图 4A）。值得注意的是，SY 暴露小鼠的谷胱甘肽（GSH）代谢通路显著富集，该现象在 DSS 处理组（图 4C）与非 DSS 处理组（图 4B）中均可见。各组 GSH 及其氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平均显著下调（P< 0.05，图 4D、E）。

图4 日落黄暴露干扰谷胱甘肽代谢。(A) 各组血清代谢组学PLS-DA得分图（n = 10）。(B) 正常小鼠SY暴露与否的差异代谢物通路分析。(C) 结肠炎小鼠SY暴露与否的差异代谢物通路分析。血清中(D)谷胱甘肽（GSH）与(E)氧化型谷胱甘肽（GSSG）的相对丰度。数据以均值±标准误表示，采用双因素方差分析结合Tukey多重比较及非配对双尾t检验；#P< 0.05，与组内对照比较。

5. SY 暴露调控 GSH 相关基因及肠道菌群功能

结肠组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽 S-转移酶（GST）、过氧化氢酶（CAT）与环氧合酶-2（COX2）的蛋白表达在 SY 暴露后均显著下调（P< 0.05，图 5A–D）。粪菌移植实验进一步显示，接受SY 菌群（FMT-SY）的小鼠结肠内 GSH-Px、GST、CAT 和 COX2 的 mRNA 水平亦显著降低（P< 0.05，图 5E–H）。Mantel 检验表明，对照与 SY 组间差异菌属与差异代谢物显著相关，其中AKK 相对丰度与 GSH 水平呈正相关（图 5I）。PICRUSt2 功能预测分析显示，无论是否合并 DSS 处理，SY 暴露均显著抑制小鼠肠道菌群的硫代谢通路（P< 0.001，图 5J）。上述结果提示，SY 通过调控宿主 GSH 相关基因及干预肠道菌群功能，协同破坏机体谷胱甘肽代谢稳态。

图5 日落黄暴露对GSH相关基因及肠道菌群功能的影响。(A–D) 慢性SY暴露小鼠结肠组织中GSH-px、GST、CAT与COX2的mRNA表达水平（n= 10）。(E–H) 粪便菌群移植处理后小鼠结肠组织中GSH-px、GST、CAT与COX2的mRNA表达水平（n= 10）。(I) 对照组与SY组间差异菌属与谷胱甘肽代谢通路差异代谢物的Mantel检验结果。(J) 基于PICRUSt 2.0预测的硫代谢通路丰度（n= 10）。数据以均值±标准误表示，采用非配对双尾t检验及双因素方差分析结合Tukey多重比较；^*P< 0.05，^***P< 0.001 vs 对照组；#P< 0.05 vs 组内对照。

6. SY 通过干扰谷胱甘肽代谢抑制 AKK 生长

体外培养实验进一步阐明SY 对嗜黏蛋白阿克曼菌（AKK）的影响。随SY 剂量升高，AKK 活菌数呈剂量依赖性下降（P< 0.05，图 6A）；SY 暴露显著升高菌内活性氧（ROS）水平（P< 0.001，图 6B），降低 GSH 含量，并抑制谷胱甘肽 S-转移酶（GST）活性（P< 0.05，图 6C、D）。RNA-seq 分析显示，SY 处理共导致 64 个差异表达基因（DEGs），其中19 个上调、45 个下调（图 6E）；3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPS）还原酶、半胱氨酸激酶（CysK）及半胱氨酸合酶（CysD）等硫代谢关键基因表达显著下调（图 6F）。GO 富集分析表明，DEGs 主要富集于硫及硫酸根相关生物过程（图 6G），硫代谢通路为 SY 干预后最显著富集的 KEGG 通路（图6H）。值得注意的是，外源补充 GSH 可显著逆转 SY 对 AKK 的生长抑制（P< 0.001，图 6I）。

图6 日落黄通过干扰谷胱甘肽代谢抑制嗜黏蛋白阿克曼菌（AKK）生长。(A) SY对AKK生长的抑制效应（n = 5）。(B) SY暴露后AKK内活性氧（ROS）水平。(C) 谷胱甘肽（GSH）含量。(D) 谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性。(E) 外源GSH补充逆转SY诱导的AKK生长抑制。(F) 差异表达基因（DEGs）数量统计。(G) AKK中3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸还原酶（PAPS reductase）、半胱氨酸激酶（CysK）及半胱氨酸合酶（CysD）的mRNA表达水平。(H) DEGs显著富集的Gene Ontology（GO）生物过程条目。(I) DEGs的KEGG通路富集分析。数据以均值±标准误表示，采用双因素方差分析结合Tukey多重比较或非配对双尾t检验；^*P< 0.05，^**P< 0.01，^***P< 0.001 vs 对照组；###P< 0.001 vs 组内对照。

自19世纪以来，饮食结构与生活方式的转变推动加工食品消费量持续攀升，同期炎症性肠病（IBD）发病率亦呈上升趋势；至20世纪后期，IBD的患病率和发生率均已显著升高。人类每日经饮食暴露于多种化学物，而儿童膳食中尤为富含可提升食品视觉吸引力的合成色素。尽管与慢性疾病相关的饮食危险因素已被广泛识别，食用色素在IBD发病机制中的作用仍缺乏系统认知。本研究首次证实，在健康状态下，广泛应用的合成色素日落黄（SY）可通过改变肠道菌群组成与功能，显著提高小鼠对结肠炎的易感性。

虽然IBD的确切病因尚未阐明，但菌群组成及功能失衡已被公认为增加IBB易感性的关键因素。本研究显示，SY暴露不仅加重DSS诱导的结肠炎症，还导致菌群失调，表现为肠道菌群健康指数（GMHI）下降及菌群失调指数（MDI）升高。粪便菌群移植（FMT）是重建肠道菌群的有效手段；无菌小鼠接受经阿斯巴甜或甜菊糖处理的肥胖供体菌群后，体重、体脂增加且糖耐量受损。因此，研究者通过FMT实验验证菌群在SY触发溃疡性结肠炎（UC）中的介导作用：接受SY暴露供体菌群的小鼠DSS结肠炎进一步恶化，证实菌群介导了SY的促炎效应，与近期关于食品添加剂-菌群互作的研究结果一致。与既往报道相符，DSS诱导的结肠炎小鼠埃希氏-志贺菌属（Escherichia-Shigella）丰度显著升高；SY还提高肠杆菌属（Enterobacter）相对丰度，该菌属在结直肠癌患者中存在过度富集。尤为重要的是，SY与DSS均导致嗜黏蛋白阿克曼菌（AKK）显著耗竭，这一现象与常见食品添加剂报道的菌群失调效应相似。AKK作为定植于肠道黏液层的有益菌，已被确定为IBD治疗的潜在靶点。上述结果共同表明，肠道菌群介导了SY对DSS诱导结肠炎的加剧作用。

代谢组学技术为IBD患者代谢谱改变及代谢通路紊乱提供了充分证据。与既往研究一致，DSS诱导的结肠炎小鼠亦表现出与对照组显著不同的代谢特征。SY暴露分别于正常状态下干扰3条、于结肠炎状态下干扰4条代谢通路，其中谷胱甘肽（GSH）代谢为共同受累通路。GSH代谢在细胞氧化还原反应中发挥核心作用，不仅提供抗氧化防御，还参与调节人体及其他生物体的多种生理过程。本研究发现，SY暴露小鼠血清中GSH及其氧化型谷胱甘肽（GSSG）浓度均显著降低。作为细胞内最丰富的抗氧化剂，GSH可中和活性氧（ROS）并限制其蓄积。细胞内GSH水平通过GSH还原酶动态维持：该酶在氧化还原循环中将GSSG还原为GSH；而GSH-Px及谷氧还蛋白等抗氧化酶则在氧化解毒过程中促进GSSG生成。

高水平ROS可在氧化应激期间造成细胞损伤，并与UC病理过程密切相关。当GSH代谢受阻时，GSH不足无法有效抵御ROS损伤，导致肠道稳态失衡。为对抗ROS介导的组织损伤，机体内源性防御系统启用GSH-Px、GST、CAT及COX2等抗氧化酶。尽管食品添加剂通常被视为安全，且SY未表现出致突变或致癌作用，少数研究甚至报道其具有抗氧化及抗炎特性，本研究却发现SY暴露加剧上述抗氧化酶基因的上调，尤其在结肠炎小鼠中更为显著，提示SY可能增强氧化应激介导的结肠损伤。这种选择性调控提示，有必要在亚健康甚至病理状态下进一步评估食品添加剂的安全性。

嗜黏蛋白阿克曼菌（AKK）与肠道及代谢健康呈正相关；已有研究证实，AKK干预可缓解高脂高胆固醇饮食诱导的氧化应激，从而抑制肠道细胞凋亡。AKK还能通过增加褪黑素合成并清除活性氧（ROS），减轻镉所致肠黏膜损伤。本研究发现，SY暴露在体内外均抑制AKK生长，且SY处理后AKK相对丰度与血清GSH水平呈正相关。空间分辨代谢组学研究表明，口服AKK可显著改变小鼠GSH代谢并提高GSH浓度，进一步支持研究者的结果。SY显著干扰肠道菌群硫代谢，在AKK中尤为突出。

SY暴露可能大幅降低AKK胞内GSH含量，并下调参与硫代谢的3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPS）还原酶、半胱氨酸激酶（CysK）及半胱氨酸合酶（CysD）表达，提示硫同化过程受损。由于半胱氨酸的可利用性是GSH生物合成的主要限速因素，硫代谢受阻将直接限制GSH生成。值得注意的是，外源补充GSH可显著逆转SY对AKK生长的抑制作用，表明SY通过破坏硫代谢诱发氧化应激，进而抑制AKK增殖。

本研究首次证实，长期SY暴露增加小鼠对DSS诱导结肠炎的易感性。SY的不良效应由肠道菌群介导，具体表现为AKK丰度降低及硫代谢紊乱；其通过破坏GSH代谢加剧肠道炎症。然而，研究仍存在局限：所用剂量未必完全反映日常平均人群暴露水平，亟需开展基于人群的流行病学研究，包括IBD患者，以明确合成色素摄入与结肠炎发生的关联。鉴于膳食产品常含多种色素，探讨不同着色剂间相互作用对结肠炎易感性的影响亦具有重要意义。随着菌群失调与IBD关系研究的深入，饮食因素已成为公共卫生关注焦点；本研究为阐明SY在结肠炎中的作用奠定基础，并为评估其他食用色素对IBD发病机制的影响提供了新思路。