PBJ | 南京农大黎星辉课题组揭示茶树炭疽病响应相关 CsMYB1-CsMYB82/CsbHLH48-CsCAD4 调控模块

研究背景

茶树（Camellia sinensis）是我国重要的叶用经济作物，炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）是茶树生产中常见且危害较重的病害之一，严重时会造成叶片病斑扩展、组织坏死和早期脱落，进而影响茶叶产量与品质。从宿主抗性机理出发提出更稳定、可持续的防控与抗性改良策略是茶叶产业亟需解决的茶学基础理论关键工作之一。苯丙烷代谢及其下游木质素沉积不仅参与细胞壁加固，还可影响病原侵入与扩展过程，是植物抗病反应中重要且复杂的代谢调控模块。尽管木质素参与抗病反应已被关注，但在茶树中仍缺乏木质素相关防御的关键转录调控网络及其导致品种间抗性差异的分子机制解析。为此，南京农业大学黎星辉教授团队以抗病品种‘中茶108’和感病品种‘龙井43’为代表材料，结合前期研究转录组学分析，鉴定到茶树中参与调控木质素合成的MYB转录因子，解析了MYB，bHLH转录因子调控木质素合成参与茶树抗炭疽病的分子机制，构建了一个与茶树炭疽病抗性密切相关的转录调控模型。

研究主要结果

1. CsMYB82负调控茶树炭疽病抗性

研究筛选到MYB家族转录因子CsMYB82，其在感病品种中受炭疽菌诱导显著上调，而在抗病品种中表达受抑制。烟草中过表达CsMYB82后降低了木质素的含量并且抗病性减弱（图1）。在茶树中通过VIGS瞬时沉默CsMYB82后，叶片木质素含量升高，接种后病斑面积较野生型减小，抗病性显著提升；而瞬时过表达CsMYB82的茶树叶片则表现为木质素积累减少、感病性增强，明确了CsMYB82通过抑制木质素积累负调控茶树炭疽病抗性（图2）。

2. 上游转录因子CsMYB1直接抑制CsMYB82转录正调控抗病性

为解析CsMYB82的上游调控机制，克隆了CsMYB82 启动子序列，通过酵母单杂交筛选获得调控因子CsMYB1，该基因与拟南芥抗病相关 AtMYB6 同源。体外酵母单杂交与体内双荧光素酶、GUS 实验证实，CsMYB1 可特异性结合 CsMYB82 启动子并抑制其转录，CsMYB1 沉默则使 CsMYB82 表达上升。亚细胞定位表明 CsMYB1 定位于细胞核，表达模式显示，抗病品种‘ZC108’中 CsMYB1 表达更高，且炭疽菌侵染后快速显著上调，感病品种‘LJ43’则无明显变化。此外在茶树叶片过表达 CsMYB1 可减轻炭疽病病症、提升木质素含量；沉默 CsMYB1 则抗病性下降，木质素无显著变化（图3）。

3. CsMYB82与CsbHLH48互作及CsbHLH48的功能分析

为探究 CsMYB82 在茶树抗炭疽病中的互作蛋白，以 CsMYB82 为诱饵进行酵母双杂交筛选，结合 MYB-bHLH 复合体在生物胁迫中的重要作用，选取 CsbHLH48 开展深入分析。酵母双杂交、双分子荧光互补、免疫共沉淀及 Split-LUC 实验均证实，CsMYB82 与 CsbHLH48 在细胞核内存在特异性相互作用。亚细胞定位显示 CsbHLH48 定位于细胞核，自然条件下 CsbHLH48 在抗病品种‘ZC108’第三叶中表达显著高于感病品种‘LJ43’，第一叶无明显差异；炭疽菌侵染后24小时，‘ZC108’中CsbHLH48显著下调，48小时时两品种均被显著抑制，72小时无显著差异。茶树瞬时过表达与沉默CsbHLH48后，炭疽病发病程度及木质素含量与对照均无显著差异，说明单独调控CsbHLH48不足以显著影响茶树炭疽病抗性及木质素积累（图4）。

4. CsMYB82直接靶向激活非典型肉桂醇脱氢酶基因CsCAD4

DAPseq 筛选发现木质素合成基因 CsCAD4为CsMYB82的直接靶标，其启动子含 ACIII 元件及多个 SMRE 元件。双荧光素酶实验表明，CsMYB82 可显著激活 CsCAD4 启动子，与 CsbHLH48 共表达后激活效应进一步增强。酵母单杂交验证 CsMYB82 可直接结合 CsCAD4 启动子，而 CsbHLH48 无直接结合能力。综上，CsMYB82 通过识别 ACIII 元件直接靶向并激活 CsCAD4，且与 CsbHLH48 形成异源二聚体协同增强转录调控，参与茶树苯丙烷代谢与抗病防御过程。进化分析显示 CsCAD4 与拟南芥 AtCAD6 聚为一支。茶树瞬时过表达 CsCAD4 会加速病害发展、增大病斑面积，沉默该基因则延缓发病、减小病斑。CAD 酶活在过表达植株中降低，沉默植株中升高；木质素含量在过表达植株中显著下降，沉默植株中显著上升。进一步调控实验表明，CsCAD4 受 CsMYB82 正调控；改变 CsbHLH48 表达对 CsCAD4 无明显影响；过表达 CsMYB1 显著抑制 CsCAD4 表达，沉默 CsMYB1 则无显著影响。综上，CsCAD4 在茶树抗炭疽病中起负调控作用，可降低木质素积累、削弱抗病性（图5）。

5. 木质素积累与CsMYB82表达的自然变异关联茶树品种炭疽病抗性

此外分析了不同叶位、不同茶树品种的木质素含量、基因表达与炭疽病抗性的关系。结果显示，感病品种‘龙井 43’比抗病品种‘ZC108’发病更早更重，同一品种内幼嫩叶片发病显著重于成熟叶片。自然条件下，相同叶位的抗病品种木质素含量显著更高；CsMYB82 与 CsCAD4 在第一叶表达量显著高于第三叶，与幼叶更易感病一致。对 6 个代表性品种鉴定发现，‘ZC108’‘碧早香’‘紫娟’表现抗病，‘龙井 43’‘福鼎大白’‘舒茶早’表现感病。抗病品种病斑面积更小、木质素积累更高。表达模式显示，侵染后 CsMYB1 在抗病品种中持续上调，CsMYB82 与 CsCAD4 则在感病品种中显著诱导、在抗病品种中受抑制；CsbHLH48 表达在品种间无明显规律。自然状态下，抗病品种 CsMYB1 表达更高，CsMYB82 与 CsCAD4 更低，木质素含量也更高。综合表明，茶树品种间炭疽病抗性差异与木质素积累及 CsMYB1–CsMYB82–CsCAD4 模块的表达模式密切相关（图6）。