动物实验结果进一步确认了DCL是木香发挥疗效的关键物质。在UUO和FA两种肾纤维化模型中,DCL治疗不仅能显著改善肾脏组织损伤、减少胶原沉积,更能有效逆转EMT等纤维化核心进程,其效果甚至优于临床阳性药物【图4】。
为揭示DCL的作用靶点,研究团队设计特异性化学探针,通过亲和纯化与质谱分析,从334个候选蛋白中锁定IQGAP1。随后,SPR、CETSA等多种生物物理方法均证实,DCL能直接、高亲和力地与IQGAP1结合,明确了其直接作用靶点【图5】。
临床分析显示,IQGAP1在肾纤维化患者及动物模型中均显著上调。功能实验证实,敲低IQGAP1可改善细胞纤维化,而过表达它则会加重纤维化表型,并能完全阻断DCL的保护作用,从而揭示IQGAP1是驱动纤维化的关键靶点【图6】。
研究通过LC-MS/MS与分子对接分析,精准定位DCL与IQGAP1蛋白的第1534位半胱氨酸共价结合。定点突变实验进一步提供了确凿证据:将Cys1534替换为丙氨酸后,DCL的结合能力与治疗效果均显著减弱,从而在原子层面阐明了其作用【图7】。
机制研究揭示,IQGAP1是调控Wnt信号通路的关键分子。实验证实,敲低IQGAP1或使用DCL处理,均能显著抑制TGF-β1诱导的Wnt通路过度激活;而过表达IQGAP1则产生相反效果。更重要的是,外源性添加Wnt通路激动剂,可抵消敲低IQGAP1所带来的保护作用,从而完整证实了该通路的关键地位【图8】。
研究进一步发现,DCL并不影响IQGAP1蛋白表达,而是通过结合IQGAP1的Cys1534位点,特异性阻断其与伴侣蛋白CCT3之间的相互作用。功能实验证实,CCT3是激活Wnt通路、驱动纤维化的关键下游分子,从而完整揭示了DCL通过靶向“IQGAP1-CCT3”轴发挥作用的全新机制【图9】。
图9.DCL阻断IQGAP1与CCT3的相互作用,抑制Wnt信号通路的异常激活,改善肾纤维化的进展
研究在动物模型上进行了最终验证。特异性敲低肾小管上皮细胞中的IQGAP1或CCT3基因,可显著改善UUO模型小鼠的肾脏损伤与纤维化,并抑制Wnt信号通路的激活,为靶向该轴治疗提供了直接证据【图10】。
图10.特异性IQGAP1或CCT3缺失抑制小鼠肾纤维化
这项工作成功实现了“AI预测—实验验证—机制阐明”的完整闭环,不仅证明了多模态AI模型在中药现代化研发中的强大赋能作用,更重要的是首次将DCL推举为极具潜力的抗肾纤维化候选药物,并揭示了一条全新的IQGAP1-CCT3-Wnt信号轴作为干预靶点。这为开发治疗CKD及肾纤维化的原创性新药奠定了坚实的理论基础,展现了人工智能与传统医学深度融合的巨大价值与广阔前景。