论文题目为Ythdf2 loss in microglia aggravates ischemic retinopathy by increasing microglia activation and microvascular anomalies，于2025 年 10 月 6 日被接收、在线发表于Journal of Advanced Research期刊，主要完成单位包括南京医科大学第一附属医院、南京医科大学附属儿童医院、南京医科大学附属宿迁第一人民医院、南通大学第二附属医院、澳大利亚新南威尔士组织库、上海交通大学医学院附属上海市第一人民医院。这篇研究围绕m⁶A 阅读蛋白 Ythdf2在视网膜微血管病变中的作用展开，首次从小胶质细胞 - 血管交互视角，揭示其调控生理血管发育与病理血管病变的分子机制，为缺血性视网膜疾病提供全新治疗靶点。
一、研究背景与科学问题
微血管功能异常是糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变等致盲眼病的核心原因，而视网膜小胶质细胞作为视网膜常驻免疫细胞，紧贴血管分布，既调控正常血管发育，也在缺氧、高糖等病理状态下异常激活，释放炎症因子破坏血管、促进病理性新生血管，形成 “炎症 - 血管损伤” 的恶性循环。
转录后调控中m⁶A 甲基化修饰是关键调控方式，Ythdf2 作为核心 m⁶A 阅读蛋白，可识别并降解靶 mRNA 维持细胞稳态，但其在视网膜小胶质细胞中是否参与血管发育与病变、具体分子通路是什么，此前完全未知。现有抗 VEGF 疗法仅针对晚期血管增殖，无法干预早期免疫炎症，亟需找到上游调控靶点。
二、研究核心目的
- 明确视网膜病变中小胶质细胞 Ythdf2的表达变化；
- 验证小胶质细胞特异性 Ythdf2 缺失对生理血管发育和病理性视网膜病变的影响；
- 解析 Ythdf2 调控小胶质细胞与血管的分子机制；
三、主要研究方法
研究构建小胶质细胞特异性 Ythdf2 敲除小鼠，结合氧诱导视网膜病变（OIR） 模型模拟缺血性视网膜病变，配套使用单细胞 RNA 测序、RNA 测序、免疫荧光、免疫印迹、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR 等技术，同时用卡托普利（Ace 抑制剂）、Noggin（Bmp4 拮抗剂）进行药物干预，AAV 病毒实现 Ythdf2 回补，从体内、体外、病理、生理多维度验证结论。
四、关键研究结果
1. 视网膜病变中，小胶质细胞 Ythdf2 特异性下调
研究先通过单细胞测序发现，OIR 小鼠视网膜小胶质细胞中Ythdf2 显著降低，且仅在小胶质细胞中出现差异表达，其他视网膜细胞无变化；体外缺氧处理原代小胶质细胞，Ythdf2 同样下调，直接证明缺血状态下小胶质细胞 Ythdf2 特异性降低，与病变进程正相关。
2. 小胶质细胞 Ythdf2 缺失，直接诱发小胶质细胞异常激活
生理状态下，小胶质细胞特异性敲除 Ythdf2 后，促炎因子 IL-6、TNF-α、IL-1β 显著升高，静息小胶质细胞标记物（Tmem119、P2ry12）下降，激活标记物（Cstb、Fabp5 等）上调；细胞形态从分支状静息态变为阿米巴样激活态，且这种激活在视网膜发育早期（P7-P14）最明显，成年后（P30）逐渐缓解。
在 OIR 病理模型中，Ythdf2 缺失会持续加剧小胶质细胞激活，大量激活态小胶质细胞聚集在新生血管周围，炎症反应进一步放大。
3. Ythdf2 缺失破坏生理性视网膜血管发育
视网膜血管分浅层、深层、中间三层丛，依次在出生后发育。小胶质细胞 Ythdf2 缺失后，血管出芽延迟、内皮尖端细胞减少、血管分支变少、重塑过快，导致三层血管丛密度、复杂度均降低；同时毛细血管结构受损，内皮细胞连接蛋白 VE-cadherin 断裂、周细胞覆盖减少，血视网膜屏障早期渗漏，这些异常同样在发育早期显著，成年后逐渐恢复。
4. Ythdf2 缺失大幅加重缺血性视网膜病理损伤
在 OIR 模型中，小胶质细胞 Ythdf2 缺失会让病理性新生血管簇显著增多，视网膜无血管区扩大，且新生血管难以正常消退；同时血视网膜屏障破坏更严重，血管渗漏加剧，最终让缺血性视网膜病变程度显著恶化。
5. 分子机制：Ythdf2 作为 m⁶A 阅读蛋白，直接调控 Ace 和 Bmp4 的 mRNA 稳定性机制研究证实，Ythdf2 通过识别Ace、Bmp4 mRNA 上的 m⁶A 位点，直接结合并促进其降解，维持两者低水平表达。
当 Ythdf2 缺失，Ace、Bmp4 的 mRNA 稳定性上升、表达大幅升高：Ace 是肾素 - 血管紧张素系统核心酶，激活后促进血管收缩、炎症与血管渗漏；Bmp4 则促进小胶质细胞激活、病理性血管生成，两者共同介导了小胶质细胞异常激活与微血管病变。
6. 靶向该通路可有效缓解视网膜病变
- 回补 Ythdf2，AAV 介导小胶质细胞特异性过表达 Ythdf2，能显著减轻 OIR 模型的新生血管与渗漏；
- 药物干预，单独使用 Ace 抑制剂卡托普利、Bmp4 拮抗剂 Noggin，均可部分逆转 Ythdf2 缺失导致的病变；联合用药效果更优，进一步验证该通路的治疗价值。
五、研究结论
- 视网膜缺血病变中，小胶质细胞 Ythdf2 特异性下调是关键分子事件；
- 小胶质细胞 Ythdf2 缺失通过上调 Ace、Bmp4，诱发小胶质细胞过度激活，既破坏生理血管发育，又大幅加重病理性缺血性视网膜病变；
- Ythdf2-Ace/Bmp4 轴是调控视网膜小胶质细胞 - 血管交互的核心通路，可作为缺血性视网膜病的全新治疗靶点；
- 卡托普利等现有药物可靶向该通路，具备快速临床转化潜力。
六、研究创新与意义
- 首次揭示小胶质细胞中 m⁶A 阅读蛋白 Ythdf2 在视网膜血管发育与病变中的核心作用；阐明免疫细胞（小胶质细胞）- 血管细胞交互的分子机制，突破既往仅关注血管内皮细胞的研究局限；提出早期免疫干预策略，弥补现有抗 VEGF 疗法仅针对晚期血管的不足；老药新用（卡托普利）降低临床转化成本，为糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变等提供全新治疗思路。
文献创新点（核心 3 条）
- 首次揭示小胶质细胞 Ythdf2 在视网膜血管病中的关键作用这是国际上首次报道小胶质细胞特异性 m⁶A 阅读蛋白 Ythdf2，同时调控视网膜生理性血管发育与病理性缺血性视网膜病变，填补了小胶质细胞转录后修饰调控视网膜微血管的研究空白。
- 阐明全新分子机制：Ythdf2-Ace/Bmp4 轴明确 Ythdf2 作为 m⁶A 阅读器，直接结合并降解 Ace、Bmp4 mRNA，通过这条通路控制小胶质细胞活化状态与血管稳态，建立了 “表观调控 - 免疫激活 - 微血管病变” 的完整机制链。
- 提出可快速转化的治疗新策略突破现有抗 VEGF 仅靶向晚期血管的局限，提出早期免疫干预思路；并证实卡托普利、Noggin可逆转病变，实现老药新用，大幅降低临床转化门槛。
文献局限性（客观 4 条）
- 仅聚焦小鼠模型，缺乏人类样本验证全部结论基于小鼠 OIR 模型与小鼠细胞，未在人视网膜组织、人小胶质细胞或临床患者样本中验证 Ythdf2-Ace/Bmp4 轴的表达与功能，物种差异可能影响临床转化。
- 机制探索不够全面只验证了 Ace、Bmp4 两个关键靶基因，未完全解析 Ythdf2 在小胶质细胞中的全部下游网络，不能排除其他靶基因共同参与调控。
- 治疗干预窗口较窄，未做长期安全性观察干预集中在小鼠出生后早期（P12–P21），未探索成年发病、晚期病变的治疗效果；也未评估 AAV 载体、长期药物使用对视网膜的长期毒性与安全性。
- 未区分小胶质细胞与巨噬细胞的贡献所用 Cx3cr1-Cre 工具鼠同时标记小胶质细胞与外周浸润巨噬细胞，无法严格证明表型完全来自视网膜原位小胶质细胞，细胞特异性存在少量混杂。
图 1：YTHDF2 在病变小胶质细胞中表达下调
主要研究内容：证明在缺血性视网膜病变（OIR）与缺氧条件下，仅视网膜小胶质细胞的 Ythdf2 表达显著降低，提示 Ythdf2 与视网膜小胶质细胞异常激活及病变进程密切相关。
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A：热图展示对照组（Ctrl）与氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠视网膜小胶质细胞中 m⁶A 调控因子的表达水平。结果显示 OIR 组小胶质细胞中 Ythdf2、Igf2bp3 表达下调。
B：利用流式细胞术分选 Ctrl 与 OIR 小鼠视网膜 CD45 阳性小胶质细胞的实验流程示意图。
C：qPCR 检测分选后小胶质细胞中 Igf2bp3 与 Ythdf2 的 mRNA 水平，证实仅 Ythdf2 在 OIR 小胶质细胞中显著降低。
D：小鼠原代小胶质细胞分离与缺氧处理的实验流程示意图。
E：免疫荧光染色验证分离的原代小胶质细胞特异性标记物 Iba-1 阳性，细胞核用 DAPI 复染，证明细胞纯度。
F：qPCR 检测常氧与缺氧处理后原代小胶质细胞中 Igf2bp3 与 Ythdf2 的 mRNA 水平，证实缺氧仅导致 Ythdf2 下调。
G：蛋白免疫印迹检测常氧与缺氧处理后小胶质细胞中 Ythdf2 蛋白表达，以 β-actin 为内参，定量结果显示缺氧组 Ythdf2 蛋白显著降低。
H：特征图展示 Ythdf2 在 OIR 与对照组小鼠各类视网膜细胞中的表达分布，显示 Ythdf2 广泛表达于视网膜各类细胞。
I：小提琴图对比 OIR 与对照组小鼠各类视网膜细胞中 Ythdf2 的表达差异，证实仅小胶质细胞中 Ythdf2 表达存在显著差异。
J：单细胞轨迹分析显示，随 OIR 病变发展的拟时间轴上，小胶质细胞中 Ythdf2 表达持续降低。
图 2：小胶质细胞特异性敲除 Ythdf2 诱导发育阶段视网膜小胶质细胞激活
主要研究内容：构建小胶质细胞特异性 Ythdf2 敲除小鼠，证实 Ythdf2 缺失会导致发育阶段视网膜小胶质细胞出现炎症因子上调、表型标记物改变、形态转为激活状态。
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A：他莫昔芬诱导小胶质细胞 Ythdf2 敲除的实验示意图，在小鼠出生后 P1-P3 连续胃内注射他莫昔芬，特异性抑制小胶质细胞中 Ythdf2 表达。
B：Ythdf2 敲除型与对照组小胶质细胞的 RNA 测序火山图，筛选标准为 | log₂FC|>1 且 P<0.05，展示差异表达基因分布。
C：GO 富集分析图，显示 Ythdf2 敲除后小胶质细胞中显著富集巨噬细胞 / 小胶质细胞激活相关生物学通路。
D：qPCR 检测敲除组与对照组小胶质细胞中炎症因子 IL-6、Tnf-α、IL-1β 的 mRNA 水平，证实敲除组促炎因子显著升高。
E：qPCR 检测静息小胶质细胞标记物（Tmem119、P2ry12）与激活标记物（Cstb、Fabp5、Trem2、Cd206、Cd163）的 mRNA 水平，显示静息标记降低、激活标记升高。
F：免疫荧光染色对照组与敲除组小胶质细胞 Iba-1，细胞核 DAPI 复染，定量细胞面积，显示敲除组小胶质细胞体积增大呈激活形态。
G：视网膜小胶质细胞形态学参数（胞体面积、分支投射区域、分支数量）的示意图。
H/J：免疫荧光染色 P7、P14、P30 小鼠视网膜平铺片 Iba-1，定量形态学指标，显示 P7-P14 敲除组小胶质细胞呈激活态，P30 恢复正常。
图 3：Ythdf2 缺失损伤发育阶段视网膜生理性血管生成
主要研究内容：证实小胶质细胞 Ythdf2 缺失会破坏视网膜浅、深、中间三层血管丛的正常发育，导致血管密度、分支、管径异常，且异常集中在发育早期。
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A：小鼠视网膜浅、深、中间三层血管丛出生后发育时序示意图，浅层（P0-P7）、深层（P8-P10）、中间层（P11-P15）依次发育。
B：免疫荧光染色 P7、P10、P14、P30 小鼠视网膜浅层血管丛（IB4 标记），白色点为分支点，白色平行线标注管径，展示血管形态差异。
C：血管面积、管径、分支点数量、平均血管长度的统计示意图与定量结果，显示敲除组 P7-P14 血管密度与复杂度显著降低，P30 恢复。
D/E：免疫荧光染色 P10、P14、P30 视网膜深层血管丛（IB4 标记）及定量结果，趋势与浅层一致。
F/G：免疫荧光染色 P14、P30 视网膜中间层血管丛（IB4 标记）及定量结果，显示 P14 敲除组血管发育异常，P30 无差异。
图 4：Ythdf2 缺失破坏生理性血管生成过程中的血管出芽与重塑
主要研究内容：明确 Ythdf2 缺失会导致视网膜血管出芽延迟、尖端细胞异常，同时加速血管修剪，是早期血管发育缺陷的直接原因。
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A：基于 RNA 测序的 GO 富集图，显示 Ythdf2 敲除小胶质细胞中血管出芽与重塑相关生物学过程显著富集。
B：免疫荧光染色 P7 小鼠视网膜平铺片 IB4，展示血管延伸范围，白色圆圈为视网膜边缘，白色虚线为血管边缘，定量显示敲除组血管延伸受阻。
C：高倍镜下 P7 视网膜血管尖端细胞形态，定量尖端细胞数量与丝状伪足，显示敲除组尖端细胞分化与出芽受抑制。
D/E：免疫荧光染色 P10、P14 视网膜 IB4，统计血管延伸范围，显示 P10-P14 血管延伸无显著差异。
F/G：免疫荧光共染色血管标记 IB4 与细胞外基质标记 Collagen IV，统计空的 ECM 套管数量，显示 P7 敲除组血管修剪过度，P30 无差异。
H：对照组与 Ythdf2 敲除组小鼠出生后视网膜血管生成与修剪的模式图，总结 Ythdf2 缺失导致早期出芽障碍、修剪加速。
图 5：Ythdf2 缺失损伤生理性血管生成过程中的毛细血管形态发生
主要研究内容：从细胞层面证实 Ythdf2 缺失破坏内皮细胞连接、减少周细胞覆盖，导致血视网膜屏障完整性受损、早期血管渗漏。
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A/B：免疫荧光共染色内皮连接蛋白 VE-cadherin 与血管标记 IB4，定量 VE-cadherin 覆盖比例，显示 P7 敲除组内皮连接断裂、覆盖降低，P30 恢复正常。
C/D：免疫荧光共染色周细胞标记 PDGFRβ 与 IB4，定量周细胞覆盖比例，显示 P7 敲除组周细胞覆盖减少，P30 无差异。
E/F：免疫荧光共染色红细胞标记 TER-119 与 IB4，定量血管外渗漏红细胞数量，显示 P7 敲除组血视网膜屏障渗漏，P30 无渗漏。
图 6：Ythdf2 缺失加剧 OIR 视网膜小胶质细胞激活
主要研究内容：在病理 OIR 模型中，证实 Ythdf2 低表达的小胶质细胞更易向促炎表型转化，Ythdf2 缺失会持续加剧小胶质细胞激活与聚集。
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A：UMAP 图展示 OIR 小鼠视网膜小胶质细胞按 Ythdf2 表达分为高、中、低三个亚群。
B：GSEA 富集图，显示 Ythdf2 低表达小胶质细胞中巨噬细胞趋化通路显著富集。
C：点图对比三个亚群小胶质细胞中 Ythdf2、静息标记（Tmem119、P2ry12）、激活标记（Cstb、Fabp5）的表达水平。
D：拟时间轨迹分析显示，随病变进展静息标记表达降低、激活标记升高。
E：Pearson 相关性分析，显示 Ythdf2 与静息标记正相关、与激活标记负相关。
F：qPCR 检测缺氧处理后敲除组与对照组小胶质细胞表型标记 mRNA 水平，证实敲除组激活标记显著升高。
G：qPCR 检测缺氧处理后小胶质细胞促炎因子 mRNA 水平，显示敲除组炎症因子显著上调。
H：小鼠 OIR 模型构建、他莫昔芬诱导及小胶质细胞形态分型（树突状静息态、阿米巴样激活态）示意图。
I/K：免疫荧光染色 P17、P21、P25 OIR 小鼠视网膜 Iba-1，定量激活态与静息态小胶质细胞比例，显示敲除组激活态小胶质细胞持续增多。
L：模式图总结 Ythdf2 缺失导致 OIR 视网膜小胶质细胞异常激活。
图 7：Ythdf2 缺失加重 OIR 视网膜新生血管生成与血视网膜屏障破坏
主要研究内容：证实小胶质细胞 Ythdf2 缺失会加剧 OIR 模型病理性新生血管、扩大无血管区，同时严重破坏血视网膜屏障完整性。
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A：免疫荧光染色 P17、P21、P25 OIR 小鼠视网膜全片 IB4，红色点为新生血管簇（NVT），灰色为无血管区，展示血管病变差异。
B/C：定量视网膜新生血管簇面积与无血管区面积，显示敲除组新生血管增多、无血管区扩大，且病变持续不消退。
D：免疫荧光共染色 VE-cadherin 与 IB4，分别定量新生血管区与非新生血管区 VE-cadherin 覆盖，显示敲除组内皮连接严重受损。
E：免疫荧光共染色 PDGFRβ 与 IB4，定量周细胞覆盖，显示敲除组周细胞覆盖显著降低。
F：免疫荧光共染色 TER-119 与 IB4，定量血管外渗漏红细胞，显示敲除组血管渗漏显著加重。
图 8：回补 Ythdf2 改善 OIR 视网膜微血管功能异常
主要研究内容：通过 AAV 病毒在小胶质细胞中特异性过表达 Ythdf2，证实回补 Ythdf2 可有效缓解 OIR 模型的病理性新生血管与血管渗漏。
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A：AAV 介导小胶质细胞 Ythdf2 过表达的实验示意图，P12 玻璃体腔注射 AAV，P21 取材检测。
B：免疫荧光染色 P21 视网膜全片 IB4，定量无血管区与新生血管簇面积，显示 AAV-Ythdf2 组病变显著减轻。
C：免疫荧光共染色 TER-119 与 IB4，定量血管外渗漏红细胞，显示回补 Ythdf2 显著减少血管渗漏。
图 9：Ythdf2 在体外通过调控 Ace 与 Bmp4 的 mRNA 稳定性影响视网膜小胶质细胞与血管表型
主要研究内容：分子机制层面证实 Ythdf2 作为 m⁶A 阅读蛋白，直接结合并降解 Ace、Bmp4 mRNA，Ythdf2 缺失导致两者表达上调。
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A：筛选 Ythdf2 下游靶基因的流程图，最终确定 Ace 与 Bmp4 为核心靶基因。
B：qPCR 检测 Ctrl 与 OIR 小鼠小胶质细胞中 Ace、Bmp4 的 mRNA 水平，显示病变组两者显著升高。
C/D：qPCR 与蛋白免疫印迹检测常氧 / 缺氧处理后小胶质细胞 Ace、Bmp4 表达，显示缺氧组两者显著上调。
E：MeRIP-Seq 展示 Ace 与 Bmp4 mRNA 上的 m⁶A 甲基化峰分布。
F：MeRIP-qPCR 验证小胶质细胞中 Ace、Bmp4 mRNA 存在 m⁶A 修饰。
G：RIP-qPCR 验证 Ythdf2 蛋白直接结合 Ace、Bmp4 mRNA。
H：转录抑制剂放线菌素 D 处理后，检测 Ace、Bmp4 mRNA 半衰期，显示敲除组两者稳定性显著升高。
I/L：qPCR 与蛋白免疫印迹检测常氧 / 缺氧下敲除组与对照组 Ace、Bmp4 表达，证实敲除组两者显著升高。
图 10：卡托普利或 Noggin 干预改善 Ythdf2 缺失诱导的 OIR 视网膜微血管功能异常
主要研究内容：证实单独或联合使用 Ace 抑制剂卡托普利、Bmp4 拮抗剂 Noggin，可有效逆转 Ythdf2 缺失导致的视网膜病变。
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A：卡托普利腹腔注射给药方案与作用机制示意图，卡托普利抑制 Ace 活性，减少血管紧张素 II 生成。
B：Noggin 玻璃体腔注射给药方案与作用机制示意图，Noggin 拮抗 Bmp4 与受体结合。
C：免疫荧光染色 P21 视网膜全片 IB4，定量联合用药组无血管区与新生血管簇面积，显示联合干预效果最优。
D：免疫荧光共染色 TER-119 与 IB4，定量联合用药组血管渗漏，显示联合干预显著减轻渗漏。图源文献，侵权删。
