药物科学的核心使命在于阐明疾病背后复杂的分子机制，并基于这些认知，开发能够精准识别并干预病理过程的新型策略。癌症作为一种系统性病理状态，不仅表现为细胞异常增殖，更深刻地反映了肿瘤微环境（TME）的异质性与动态演化特性。在如此复杂的系统中，传统单功能模式的小分子药物易产生耐药性，疗效降低，且缺乏肿瘤特异性识别能力，常对正常组织造成附带损伤。此外，这类药物也无法满足病灶定位、实时监测和精准干预等更高层次的临床需求。这些局限性凸显了开发具有更高特异性、高效性和可控性的创新分子药物系统的迫切性，最终通过多模式协同实现诊疗功能的一体化。
为提高癌症治疗的选择性和安全性，靶向前药策略应运而生。抗体药物偶联物（ADCs）使用单克隆抗体作为载体，率先实现了细胞毒性药物的选择性递送，并已取得临床成功，例如曲妥珠单抗‑恩美曲妥珠单抗（trastuzumab‑emtansine）和本妥昔单抗（brentuximab vedotin）。然而，这类大分子药物在实体瘤中的穿透能力受限，同时其较低的药物抗体比（DAR ≤ 8）使得只能搭载高细胞毒性的有效载荷，这可能导致药物脱靶释放时产生严重的全身毒性，此外还存在潜在的免疫原性和高昂的生产成本。多肽药物偶联物（PDCs）被提出作为替代方案。PDCs 用小肽替代抗体，具有化学可调性、多价性、更强的肿瘤穿透能力、快速清除以及免疫原性降低等优势，但依然容易受到蛋白水解降解的影响，这可能削弱其靶向准确性和体内稳定性（方案 1A）。临床上确实存在成熟的多肽类诊疗一体化平台，最突出的是基于多肽靶向的放射性诊疗对，例如 177Lu‑DOTA‑TATE/68Ga‑DOTA‑TATE 和 177Lu‑PSMA‑617/68Ga‑gozetotide。然而，这些系统主要依赖匹配的诊断性/治疗性放射性配体，而非将成像与多模式治疗功能集成于单一分子。因此，开发集成度更高的多肽分子体系仍是下一代靶向药物设计的重要方向。
光疗，包括光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT），因其可通过外部光照进行可控激活，从而具备内在的空间精准“点射”式治疗能力，已成为一种颇具前景的治疗模式。当与光学成像引导相结合时，光疗还能提供病灶定位和实时监测，使其成为集成式诊疗一体化平台中的一个有吸引力的选择。尤其是近红外二区（NIR-II，1000−1700 nm）光，具有穿透组织深、吸收和散射极低的优势，是成像引导治疗的有力工具。然而，缺乏能够统一诊断与治疗功能的强有力单分子光敏剂，仍然是临床转化的一大瓶颈。根据雅布隆斯基能级图，光敏剂通过辐射跃迁和非辐射跃迁途径耗散吸收的光子能量：辐射衰变产生用于成像的荧光，而非辐射衰变则驱动光热转换和系间窜越，产生活性氧（ROS）用于PDT。因此，合理的光敏剂设计需要在一个分子内精细平衡这些相互竞争的能量耗散途径，从而实现统一的诊疗功能。迄今为止，基于花菁类、罗丹明类、BODIPY衍生物以及D-A/D-A-D型分子的光敏剂已有大量报道。通过系统分析近期NIR-II成像引导的光疗药物研究进展（表S1），作者发现尽管这些药物具有令人鼓舞的潜力，但仍存在若干固有局限性：（1）摩尔消光系数（ε）是决定光子捕获能力的关键参数，但许多已报道的小分子NIR-II光诊疗试剂的ε仍低于5 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹，这限制了光疗性能的上限。（2）依赖延长共轭和增强平面性的分子设计往往水溶性较差。在极性水环境中，共轭对称性的破坏会显著降低ε，而强烈的π-π堆积相互作用会诱导聚集导致猝灭（ACQ），从而丧失荧光成像能力。（3）对肿瘤微环境的响应不足，导致无法区分恶性组织和正常组织，从而不可避免地产生全身毒性。（4）依赖纳米颗粒载体（如脂质体、聚合物包载或血清蛋白结合）来提高溶解度并实现被动靶向，引入了制备复杂、批次差异和潜在的安全性问题。值得注意的是，一项荟萃分析显示，纳米颗粒在人类肿瘤中的中位积聚量很少超过注射剂量的0.7%，这凸显了仅依赖高渗透长滞留（EPR）效应的内在低效性。（5）单一模式的光疗不足以应对肿瘤异质性，尤其是对深部原发灶和微转移灶。综上所述，这些局限性促使人们开发集成度更高的分子系统，将选择性激活、靶向能力和多模式治疗功能结合起来。
近年来，光疗与化疗的整合催生了多种肿瘤微环境响应型前药设计，特别是缺氧激活前药（HAPs）。Peng等人报道了一种基于菁染料的HAP，其缺氧触发的裂解能够实现药物的可激活释放，并同时发挥光热治疗作用。Zhang等人进一步将缺氧敏感的偶氮连接臂引入II型光敏药物偶联物中，将光疗增强的缺氧与可激活化疗及成像读出功能相耦合。相关策略还通过采用双光子吸收的铱配合物拓展到了近红外可激发系统。这些研究突显了缺氧响应型光疗前药在协同治疗癌症方面的前景。然而，II型光动力疗法的氧依赖性限制了其在缺氧肿瘤中的有效性，而I型光动力疗法主要依赖电子转移过程而非直接敏化单线态氧，因此能更好地耐受低氧条件。此外，高效的II型光敏化需要约0.98 eV的三线态能量才能将基态氧转化为单线态氧。然而，许多近红外荧光团的三线态能量较低，不利于高效II型光化学过程，反而更适合作为I型光诊疗试剂。这一特点与近红外二区窗口的深部组织成像能力相结合，使得此类系统成为集成式肿瘤诊疗的一个有吸引力的方向。尽管如此，开发能够将近红外二区成像引导与协同多模式治疗功能相结合的单分子试剂仍然极具挑战性。
为应对这些挑战，作者将靶向前药与光疗原理相结合，设计了一种肽-光敏剂-药物偶联物（P2DC）前药——IT-azo-RGD（方案 1B）。该设计采用具有高摩尔消光系数的吲哚菁作为光敏核心。在吲哚两侧引入扭曲的三苯乙烯单元，赋予其“分子内运动受限（RIM）”特性，从而调控辐射与非辐射能量耗散途径。在理论计算指导下，该设计还规避了菁染料中meso位连接体常伴随的PET过程所导致的荧光猝灭风险，从而确保了稳定的近红外二区成像能力、高效的光热转换效率以及I型光动力活性。同时，作者合理地在光疗模块与化疗模块之间引入缺氧敏感的偶氮键作为响应性连接臂，并进一步将其与两拷贝的整合素靶向肽cRGDfK偶联，使其在水溶液中自组装形成纳米球，从而实现三重靶向机制：多价整合素受体靶向（通过双cRGDfK）、被动蓄积（通过纳米球的EPR效应）以及缺氧肿瘤微环境选择性激活（方案 1C）。理论分析为光物理行为、活性氧生成以及纳米球解组装诱导的药物释放提供了机制性见解，这些与实验观察结果一致。在原位骨肉瘤小鼠模型中，IT-azo-RGD实现了实时近红外二区成像，通过缺氧激活化疗、增强的光热-光动力效应实现协同肿瘤抑制，并防止肺转移，且未观察到明显的全身毒性（方案 1D）。该工作展示了P2DC概念在成像引导多模式肿瘤治疗中的潜力，并为单分子诊疗试剂的开发提供了一个合理的分子设计范例。
方案 1. 本研究示意图。（A）受靶向药物演化轨迹启发的设计理念。（B）P2DC 的模块化结构。（C）缺氧激活的药物释放及 IT-azo-RGD 在释放前后的相应纳米结构变化。（D）IT-azo-RGD 激活化学-光热-光动力联合疗法用于骨肉瘤消融的作用机制。
图 1. 分子设计与光谱性质。（A）IT-azo-RGD 分子设计策略示意图。（B）IT-p-NH₂-RGD 和（C）IT-m-NH₂-RGD 中基于 SLEET 模型的光致电子转移（PET）概率分析，附有计算得到的激发/退激发能量及振子强度（f）。注：能级未按比例绘制。（D）IT-p-NH₂-RGD 和（E）IT-m-NH₂-RGD 的优化分子几何结构及电子/空穴分布。VES：垂直激发态，AES：绝热激发态。（F）染料 IT-m-NH₂ 和 IT-p-NH₂ 在乙醇中的吸收和发射光谱。（G）IT-azo 和 IT-azo-RGD 在水中的吸收和发射光谱对比。
图 2. IT 染料工作机制的计算解析及光疗性能的体外评估。（A）IT 染料在光激活和失活过程中的势能面，同时标注了系间窜越的能隙和自旋-轨道耦合值。注：为简化计算，省略了对激发态能级影响可忽略的多肽末端；能级未按比例绘制。（B）IT 染料的电子（蓝色）和空穴（红色）分布，红色箭头指示主要的系间窜越途径。使用 DCFH、DHR123 和 HPF 作为探针，在 808 nm 激光照射（300 mW cm⁻²）下检测 ICG 和 IT 分子产生的（C）总活性氧（ROS）、（D）超氧阴离子（O₂•⁻）和（E）羟基自由基（•OH）。（F）在暗处或激光照射下，使用 5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）表征 •OH 的电子顺磁共振（EPR）谱。（G）在 808 nm 激光照射（300 mW cm⁻²，10 分钟）下，IT 染料和 ICG（20 μM）的红外热像图。（H）不同浓度 IT-m-NH₂-RGD 的时间依赖性光热曲线。（I）IT-m-NH₂-RGD（20 μM）在激光照射下的加热和冷却曲线，以及冷却阶段线性时间数据与 -lnθ 的关系图。（J）与 ICG 相比，IT 染料的循环加热/冷却稳定性。
图 3. IT-azo-RGD 的缺氧响应性聚集态转变与药物释放。（A）IT-azo-RGD 在水中 0 ns 和 100 ns 时的分子动力学快照；（B）对应的 100 ns 内相互作用能变化。（C）药物释放后 IT-azo-RGD 在水中 0 ns 和 100 ns 时的分子动力学快照；（D）对应的 100 ns 内相互作用能。（E）缺氧条件下偶氮还原酶（AZR）触发偶氮断裂、有效载荷释放以及 IT-azo-RGD 纳米结构随之解组的示意图。（F）IT-azo-RGD 在 PBS 中自组装纳米结构的透射电镜（TEM）图像；插图：溶液的丁达尔效应。比例尺：200 nm。（G）IT-azo-RGD（5 μM）在 PBS 中加入大鼠肝微粒体（RLM，50 μL）和 NADPH（50 μM）还原后的 TEM 图像；插图：还原后的丁达尔效应。比例尺：200 nm。（H）IT-azo-RGD 在 PBS 中的动态光散射（DLS）粒径分布及 Zeta 电位测量值（插图）。（I）用于研究 IT-azo-RGD 在 143B 细胞中胞内药物释放动力学的实验流程示意图。离心机和 HPLC 图标使用 BioRender 绘制。He, X. (2025) https://BioRender.com/y94t517。（J）苯胺氮芥、IT-azo-RGD、IT-m-NH₂-RGD 和 4-氨基苯甲醇的高效液相色谱（HPLC）保留时间。（K）在缺氧（1% O₂）条件下将 IT-azo-RGD 与 143B 细胞共孵育 24 h 的 HPLC 监测结果，显示不同时间点的药物释放。（L）24 h 后胞内残留物的 MALDI-TOF 质谱图。
图 4. 细胞内活性氧（ROS）生成的评估。（A）不同处理组在常氧和缺氧条件下，用 DCFH-DA、DHE 和 HPF 预染色的 143B 细胞的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，BF 表示明场。比例尺：DCFH-DA 和 DHE 为 50 μm；HPF 为 20 μm。（B）不同条件下 143B 细胞中 HPF 荧光强度的流式细胞术分析。（C−E）从不同处理组的 CLSM 图像中提取的 DCF、HPF 和 DHE 荧光强度的定量分析。（F）不同处理组中 HPF 阳性细胞比例的流式细胞术分析。
图 5. IT-azo-RGD 的细胞毒性评估。（A）IT-azo-RGD 的缺氧选择性化学毒性与光毒性示意图。（B）在不同处理条件下，IT-azo-RGD 对 143B、MG63 和 Saos-2 细胞的细胞毒性，以 IT-m-NH₂-RGD 作为光毒性对照。（C）不同处理后，经 Calcein-AM 和 PI 共染色的 143B 细胞的共聚焦荧光图像。比例尺：250 μm。（D）不同处理后 143B 细胞的集落形成图像。（E）集落数量的定量分析（n = 3）。（F）不同处理诱导的 143B 细胞 G0/G1 期阻滞的细胞周期分析。（G）不同处理下 143B 细胞在各细胞周期阶段的分布；G0/G1 期比例的差异经统计学分析（n = 3）。（H）流式细胞术检测 143B 细胞的凋亡情况。Q4：活细胞，Q3：早期凋亡细胞，Q2：晚期凋亡细胞，Q1：坏死细胞。（I）不同处理组中 143B 细胞凋亡比例的定量分析（n = 3）。
图 6. IT-azo-RGD 在 143B 细胞中的机制研究。（A）通过 γ-H2AX 免疫荧光和 TUNEL 检测评估四个处理组的 DNA 损伤情况。比例尺：20 μm。（B）采用 JC-1 染色和 GreenNuc 检测 143B 细胞中的线粒体膜电位分析及 caspase-3 活性。比例尺：20 μm。（C）γ-H2AX 免疫荧光、（D）TUNEL 阳性细胞核、（E）JC-1 单体/聚集体比值以及（F）GreenNuc 标记的 caspase-3 活化的定量荧光强度分析。（G）caspase-3 活性和线粒体去极化的流式细胞术图谱。Q1：正常细胞（膜电位完整）；Q3：早期凋亡细胞；Q4：晚期凋亡/坏死细胞。（H）各处理组中正常细胞比例的定量分析（n = 3）。（I）四个实验组中凋亡相关蛋白的蛋白质印迹（Western blot）分析。（J）接受化疗与光疗联合处理的 143B 细胞的多维基因富集分析。（K）IT-azo-RGD 在缺氧条件及 808 nm 激光照射下诱导细胞凋亡的 proposed 信号通路示意图。
图 7. 注射 IT-azo-RGD 后 143B-luc 原位骨肉瘤小鼠的体内近红外二区（NIR-II）荧光成像。（A）小鼠腹侧脉管系统的大体血管成像。比例尺：10 mm。（B）脑部、（C）腹部和（D）肿瘤周围血管的成像，并附有相应感兴趣区域（ROIs）的放大视图。比例尺：全景图为 2.0 mm，放大图为 200 μm。（E）背侧脉管系统的大体成像。比例尺：10 mm。相邻放大图像中沿虚线方向的横断面发光强度分布（散点图）及高斯拟合曲线（曲线）：（F）下肢血管，（G）不同解剖区域的毛细血管网络，（H）背侧脉管系统，通过高斯拟合分析显示血管宽度及半定量信背比。（I）静脉注射 IT-azo-RGD（0.20 mM，100 μL）后，143B 荷瘤小鼠的全身 NIR-II 成像，以 IT-m-NH₂-RGD（等剂量）作为成像对照。（J）60 小时内肿瘤区域平均 NIR-II 荧光强度的时间变化曲线。所有图像均采用 1300 nm 长通滤光片采集，曝光时间为 500 ms。
图 8. IT-azo-RGD 在 143B-luc 原位骨肉瘤小鼠模型中的体内抗肿瘤疗效。（A）143B-luc 异种移植荷瘤小鼠的肿瘤接种与治疗方案示意图。小鼠图标使用 BioRender 绘制。He, X. (2025) https://BioRender.com/y94t517。（B）808 nm 激光照射下肿瘤区域的红外热像图。（C）10 分钟内肿瘤区域的温度变化曲线（n = 3）。（D）治疗后各组小鼠的肿瘤重量（n = 5）。（E）各组离体肿瘤的照片。（F）20 天治疗期间小鼠的肿瘤体积生长曲线及（G）体重曲线。（H）不同治疗条件下 143B-luc 荷瘤小鼠的生存曲线。（I）143B-luc 荷瘤小鼠的个体肿瘤生长曲线。（J）显示各组代表性小鼠胫骨损伤修复情况的三维重建图像。（K）治疗后肺转移的代表性图像及相应的 H&E 染色。比例尺：全景图 2.0 mm，放大图 200 μm。（L）肿瘤组织切片的组织学分析。比例尺：100 μm。
在本研究中，作者提出了一类新型单分子肽-光敏剂-药物偶联物（P2DC）的合理设计策略。该设计以定制化的光敏剂为核心，将共轭的三苯乙烯连接臂引入吲哚菁杂环中，构建具有分子内运动受限（RIM）特征的四苯乙烯结构单元。在SLEET能级预测模型的指导下，优化了meso位取代连接臂的构型，有效减轻了光致电子转移（PET）诱导的荧光猝灭。该设计协同优化了辐射与非辐射衰变途径，从而使光敏剂兼具成像与光疗功能。所得前药IT-azo-RGD整合了双cRGDfK多肽，实现对整合素受体的多价靶向；同时其在水溶液中自组装形成纳米球的能力，促进了通过EPR效应的被动蓄积。此外，缺氧敏感的偶氮连接臂赋予了肿瘤微环境响应性，从而构建了三重靶向机制。在缺氧条件下，偶氮键断裂触发药物释放并解组装为单分子，启动化疗，同时增强光物理性能，包括提高光热转换效率（59.7%）和I型光动力介导的羟基自由基生成。这些观察结果得到了理论计算的有力支持，为分子设计和功能验证提供了坚实依据。在体外，IT-azo-RGD表现出高效的近红外二区荧光成像以及稳健的光热和光动力活性，与理论预测一致。机制研究进一步表明，其细胞毒性涉及DNA损伤、线粒体膜去极化和caspase-3级联激活，共同导致细胞凋亡。在体内，IT-azo-RGD在原位骨肉瘤模型中实现了近红外二区引导的多模式治疗，取得了显著的肿瘤生长抑制率（97.7%）并延长了生存期。组织学和影像学分析证实了有效的肿瘤消融，且全身毒性极低。总之，本工作引入了一种缺氧激活的多模式前药，建立了一个整合理论预测、分子设计和实验验证的闭环范式。本文所述的P2DC策略可能为开发兼具诊断与治疗潜力的肿瘤靶向平台提供一种通用的分子框架。
文献链接：https://doi.org/10.1021/acsnano.6c01282
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