JAFC 南京师范大学-解脂耶罗维亚酵母的系统代谢工程改造用于高效生产二十二碳六烯酸

Abstract

二十二碳六烯酸（DHA）是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，因其对人体健康具有显著的生理功能而被广泛应用于保健产品和婴儿配方食品中。传统的深海鱼虾提取方式在工业化和可持续合成方面受到限制。解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）是多不饱和脂肪酸合成的优良宿主。然而，关于在解脂耶罗维亚酵母中生产DHA的报道有限。在本研究中，通过系统的代谢工程改造，成功构建了能够生产DHA的解脂耶罗维亚酵母菌株，改造策略包括筛选高效延伸酶/去饱和酶、增加关键基因拷贝数，以及通过替换为偏好DHA-CoA的酰基转移酶来促进DHA的储存。最终，工程菌株在5 L生物反应器中的DHA产量达到了9.06 g/L，含量为36.8%，这是目前在酵母中报道的最高产量。本研究拓展了DHA绿色可持续合成的方法。

Introduction

二十二碳六烯酸（DHA）是一种必需的ω-3多不饱和脂肪酸，不仅能为生命活动提供能量，还对婴幼儿大脑发育、心脑血管疾病及神经退行性疾病具有显著功效。DHA被广泛应用于保健品、医疗和婴幼儿配方食品中。人体无法自身合成DHA，必须从食物中获取。根据规定，1段和2段奶粉中DHA的添加量应维持在3.6 mg−9.6 mg/100 KJ（GB 10765-2021），这对总脂肪酸中的DHA含量提出了更高要求。根据Grand View Research的研究报告，预计2023年ω-3多不饱和脂肪酸的全球市场规模为26.2亿美元，到2030年将达到44.5亿美元，复合年增长率为7.9%。其中，DHA以超过56%的收入份额占据市场主导地位。深海鱼油是DHA的主要商业来源。然而，由于季节性波动、海洋资源匮乏以及海洋污染，其可持续性和可获得性受到限制。因此，有必要开发绿色、高效的DHA生产方法，以填补巨大的市场缺口并减轻渔业资源的负担。

微生物发酵因其工艺稳定和产量可靠而成为一种有前景的替代方法。合成DHA有两种天然途径：聚酮合酶途径以及延伸酶和去饱和酶途径。聚酮合酶途径是一个多结构域的超大蛋白，每个结构域按特定模式排列，利用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A作为底物实现DHA的从头合成。聚酮合酶途径主要存在于一些海洋细菌和微藻中，如裂殖壶菌，这是目前商业DHA生产的主要来源。然而，聚酮合酶各功能域控制脂肪酸合成的机制尚未被完全解析，这也限制了聚酮合酶在其他微生物中的功能改造和应用。相比之下，延伸酶和去饱和酶途径的机制是清晰的。该途径通过脂肪酸合酶合成饱和脂肪酸——棕榈酸（C16:0, PA）和硬脂酸（C18:0, SA）。SA在Δ9去饱和酶的催化下转化为油酸（C18:1, OA），然后在Δ12去饱和酶的催化下转化为亚油酸（C18:2, LA）。以LA为底物，DHA可以通过Δ-6途径或Δ-9途径合成（图1A）。延伸酶和去饱和酶途径主要存在于裸藻和真菌中，如纤细裸藻和高山被孢霉，并已在解脂耶罗维亚酵母、大肠杆菌和酿酒酵母等多种微生物中开发应用，用于生产各种脂肪酸，如二十碳五烯酸、花生四烯酸和γ-亚麻酸。

解脂耶罗维亚酵母被认为是一种“公认安全”的微生物，不仅是合成天然产物的优良宿主，也是研究最广泛的非常规酵母之一。解脂耶罗维亚酵母拥有丰富的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A（脂质合成的前体），并且在氮源限制下，脂质积累可达到其细胞干重的70%以上。因此，解脂耶罗维亚酵母因其出色的生长性能和丰富的脂质积累，被视为建立脂质细胞工厂的有前景的候选菌株。近年来，随着合成生物学技术的兴起以及基因代谢工具的不断发展和完善，解脂耶罗维亚酵母已被开发成为生产脂类、油脂化学品、和萜类化合物等高价值化合物的细胞工厂。Gemperlein等人将源自粘细菌的聚酮合酶途径基因整合到解脂耶罗维亚酵母的基因组中，获得了DHA含量为16.8%的工程菌株，这是将聚酮合酶途径整合到解脂耶罗维亚酵母基因组中生产DHA的首个成功案例。杜邦公司的科学家通过过表达30个拷贝的延伸酶和去饱和酶基因，构建了EPA含量高达56.6%的工程菌株。在此基础上，通过过表达Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶，获得了DHA含量为5.6%的生产DHA的工程菌株。这一进展证实了解脂耶罗维亚酵母作为DHA生产候选宿主的潜力。然而，目前通过延伸酶和去饱和酶途径合成DHA的研究仍然有限，这可能是由于合成途径过长或中间脂肪酸产物过多，限制了DHA细胞工厂的开发。

在本研究中，通过设计高效的DHA生物合成途径对解脂耶罗维亚酵母进行了改造。一方面，利用启动子工程优化延伸酶和去饱和酶途径的代谢流平衡，并结合增加关键基因拷贝数来提高延伸酶/去饱和酶的表达水平。另一方面，筛选偏好DHA-CoA的酰基转移酶，可以增强DHA在三酰甘油中的储存能力，从而促进DHA的积累。最后，在5 L生物反应器中表征了产DHA工程菌株的脂质生产和发酵性能。本研究为开辟绿色、经济、可持续的DHA生产策略提供了支持。

关于通过延伸酶和去饱和酶途径在微生物中合成DHA的研究十分有限。解脂耶罗维亚酵母拥有丰富的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，以及成熟的基因编辑工具，表明其作为DHA生产平台具有非凡的潜力。因此，选择解脂耶罗维亚酵母Po1f作为构建DHA合成途径的起始菌株。解脂耶罗维亚酵母Po1f中存在天然脂肪酸，包括PA、SA、OA和LA。为了提高DHA的合成效率，选择了Δ-9途径（粗线）用于DHA生产15（图1A）。基于先前报道的不同来源的延伸酶和去饱和酶在催化效率上的差异，选择了来自球等鞭金藻（Isochrysis galbana）的IgΔ9E、来自灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）的CcΔ8D、来自高山被孢霉（Mortierella alpina）的MaΔ5D、来自瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）的PaΔ17D，以及来自裂殖壶菌（Parietichytrium sp.）的PaΔ5E和PaΔ4D，并通过Golden Gate组装法进行组装（图1B）。将经过密码子优化的这六个基因的表达盒通过同源重组整合到解脂耶罗维亚酵母Po1f基因组中的PEX10位点，同时靶向敲除参与脂肪酸降解途径的PEX10基因，构建得到工程菌株YlPDHA01。工程菌株YLPDHA01的DHA含量最高达到2.53%（图1C），实现了DHA在解脂耶罗维亚酵母中的从头合成。同时，起始菌株和工程菌株的生长未受到显著影响。

工程菌株YLPDHA01新合成的脂肪酸还包括二十碳二烯酸（EDA）、二高-γ-亚麻酸（DGLA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳五烯酸（DPA）。值得注意的是，DPA的积累可能是由于PaΔ4D的活性较低。筛选对底物具有强催化活性的酶是提高底物转化率的有效手段。为了进一步促进DPA向DHA的转化，将PaΔ4D替换为来自等鞭金藻（Isochrysis sp.）的IsΔ4D和来自海洋微拟球藻（Ostreococcus lucimarinus）的OlΔ4D，分别构建了工程菌株YlPDHA02和YlPDHA03。结果表明，携带IsΔ4D基因的工程菌株YlPDHA02的DHA含量最高，达到4.58%，是工程菌株YlPDHA01的1.81倍（图1D）。这表明IsΔ4D对DHA表现出强催化活性，因此选择IsΔ4D进行后续实验。

启动子的强度对于调控基因表达水平至关重要。Ji等人表征了不同培养条件下解脂耶罗维亚酵母中内源性启动子的强度，并将其分为强、中、弱启动子。并非代谢途径中的所有基因都需要高水平表达。例如，当在酿酒酵母或解脂耶罗维亚酵母中引入负责β-胡萝卜素生物合成的三个基因时，当CrtI和CrtYB的表达剂量远高于CrtE时，可以获得更高的产量。通过用minLEU2启动子替换多不饱和脂肪酸簇的组成型TEF启动子，DHA产量提高了16倍。因此，为了促进DHA的进一步合成，优化了参与延伸酶和去饱和酶途径的六个基因的启动子。同样使用Golden Gate组装法来组装不同的启动子（TEF、TEFin、EXP、FBA、FBAin、hp8d、YAT、GPD、GPDin和ILV5）、目的基因和终止子（CYC1T、XPR2T、Mig1T、Lip2T、Lip1T和XPR2T）。这些启动子常用于构建各种细胞工厂。以相同的方式将基因表达盒整合到Po1f基因组的PEX10位点，获得了工程菌株YlPDHA04至YlPDHA011。在这些工程菌株中，DHA的含量范围为3.91%至11.05%（图2A）。不同的启动子组合对DGLA、ARA、EPA、DPA和DHA的含量有显著影响（图2B）。工程菌株YlPDHA04的DHA含量最低，为3.91%。最高的DHA含量出现在工程菌株YlPDHA08中，含量为11.05%，滴度为197.8 mg/L，是工程菌株YlPDHA03的2.60倍（图2C）。此外，启动子的优化并未对菌株的生长产生影响。结果表明，启动子优化是促进DHA生产的有效策略。然而，有限的启动子组合导致无法最大化DHA产量。在合理的时间内快速识别最佳的启动子组合是费时费力的。未来可以通过整合人工智能来实现启动子的快速优化。

在之前的实验中，获得了工程菌株YlPDHA08，其DHA产量最佳，达到197.8 mg/L（图2C）。然而，仍然存在中间脂肪酸（如PA、OA、LA和DPA）的积累，导致碳通量未能有效转化为DHA（图2B）。为了提高前体脂肪酸向DHA的转化效率，增加了关键基因的拷贝数，这是提高基因表达水平的常用策略。例如，优化基因（Elo16、Des9、Des12、Elo9、Des8、Des5和Des17）的拷贝数显著提高了EPA含量。30 为了“推动”PA、OA和LA向DHA的转化，通过构建工程菌株YlPDHA012至YlPDHA016，测试了不同拷贝数组合的基因（YlC16E、YlΔ12D和IgΔ9E）对DHA含量的影响。如图3A所示，所有工程菌株的DHA滴度均有所提高。工程菌株YlPDHA015表现出最佳的DHA滴度，达到302.94 mg/L，是工程菌株YlPDHA08的1.53倍。此外，与工程菌株YlPDHA08相比，该工程菌株中PA、OA和LA的含量显著降低。YlPDHA015菌株的PA、OA和LA含量分别比YlPDHA08菌株降低了21.7%、28.5%和18.9%，达到21.5%、9.7%和13.8%（图3B）。同时，DPA的积累有所增加，这可能是由于途径不平衡所致。为了将碳通量从DPA“拉向”DHA，我们在YlPDHA015菌株中过表达了不同拷贝数的IsΔ4D基因，获得了工程菌株YlPDHA017至YlPDHA020（图3C）。与YlPDHA015菌株相比，YlPDHA017至YlPDHA020菌株的DHA滴度提高了6.12%至38.6%。其中，工程菌株YlPDHA019表现出最佳的DHA滴度，达到435.43 mg/L（图3C）。DPA含量显著降低，从YlPDHA015菌株的11.14%降至YlPDHA019菌株的5.49%（图3D）。然而，当IsΔ4D基因拷贝数从4增加到5时，未观察到DHA含量的显著增加，表明IsΔ4D基因的最佳拷贝数为4。结果表明，增加延伸酶和去饱和酶基因的拷贝数可以有效地将碳通量引导至DHA的合成，从而显著提高产量。

通过延伸酶和去饱和酶途径合成的游离脂肪酸需要被组装到脂质中才能保持稳定。在解脂耶罗维亚酵母中，三酰甘油是脂质储存的主要形式，可占总脂质的70%。游离脂肪酸通过Kennedy途径组装成三酰甘油，该途径涉及三种关键酶：glycerol-sn-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）和二酰基甘油酰基转移酶（DGAT），它们分别催化酰基辅酶A连接到甘油骨架的sn-1、sn-2和sn-3位置，形成三酰甘油（图4A）。不同来源的酰基转移酶对底物酰基辅酶A具有不同的偏好性。例如，来自欧洲油菜的DGAT对ALA-CoA具有更强的偏好性，而来自三角褐指藻的DGAT对PA-CoA具有更强的偏好性。为了增强DHA在三酰甘油中的储存能力，筛选了来自不同来源的关键酶。首先，将来自裂殖壶菌（ScGPAT）、三角褐指藻（PtGPAT）和利文斯顿氏希瓦氏菌（SlGPAT）的GPAT整合到YlPDHA019菌株的Intc位点，分别构建了工程菌株YlPDHA-G1至YlPDHA-G3。脂肪酸谱分析显示，来自这三种来源的GPAT对DHA-CoA没有显著的偏好性。其中，过表达SlGPAT基因的YlPDHA-G3菌株的脂质和DHA滴度最高，分别达到2.62 g/L和575.8 mg/L，是YlPDHA019菌株的1.37倍和1.32倍（图4B）。此外，EPA含量从YlPDHA019菌株的1.86%增加到YlPDHA-G1菌株的2.91%，因此ScGPAT可能对EPA-CoA有显著的偏好性。此外，过表达ScGPAT、PtGPAT和SlGPAT基因分别对工程菌株的生长没有影响。

然后，将来自裂殖壶菌（ScLPAAT3、ScLPAAT1、ScLPAAT2）和冬菟葵（EhLPAAT）的LPAAT整合到YlPDHA019菌株的Intc位点，分别构建了工程菌株YlPDHA-L1至YlPDHA-L4。结果表明，ScLPAAT1显示出对DHA-CoA的偏好性，DHA含量从YlPDHA019菌株的22.65%增加到YlPDHA-L2菌株的25.62%。过表达ScLPAAT2基因的YlPDHA-L3菌株的脂质滴度最高，达到2.93 g/L，是YlPDHA019菌株的1.53倍。然而，YlPDHA-L3的DHA滴度并非最佳。过表达ScLPAAT1基因的YlPDHA-L2菌株的DHA滴度最高，达到652.80 mg/L，比YlPDHA019菌株提高了49.2%（图4C）。此外，SA含量从YlPDHA019菌株的5.27%分别增加到YlPDHA-L1菌株的8.16%和YlPDHA-L4菌株的6.83%，因此过表达ScLPAAT3和EhLPAAT基因对SA的合成均有积极影响。此外，过表达ScLPAAT1、ScLPAAT2和EhLPAAT确实对工程菌株的生长有积极影响。

最后，以相同方式测试了来自裂殖壶菌（Sc7100、Sc8232）和莱茵衣藻（CrDGAT）的DGAT，分别构建了工程菌株YlPDHA-D1至YlPDHA-D3。Sc7100显示出对DHA-CoA的偏好性，DHA含量从YlPDHA019菌株的22.65%增加到YlPDHA-D1菌株的25.04%。过表达Sc7100基因的YlPDHA-D1菌株的脂质和DHA滴度最高，分别达到2.96和740.56 mg/L，是YlPDHA019菌株的1.54倍和1.70倍（图4D）。此外，OA含量从YlPDHA019菌株的10.66%增加到YlPDHA-D1菌株的14.01%，因此Sc7100可能对OA-CoA有显著的偏好性。此外，过表达Sc7100、Sc8232和CrDGAT确实对工程菌株的生长有轻微的积极影响。

结果表明，选择对DHA-CoA具有强偏好性的酰基转移酶来促进DHA在三酰甘油中的积累，对实现DHA的高效生产具有显著的积极影响。因此，选择SlGPAT、ScLPAAT1和Sc7100进行后续实验。

为了促进DHA生产，将SlGPAT、ScLPAAT1和Sc7100基因同时整合到工程菌株YlPDHA019的Intc位点，获得工程菌株YlPDHA021。如图4D所示，与YlPDHA019菌株相比，工程菌株YlPDHA021的脂质和DHA滴度分别提高了56.6%和88.9%，最高达到3.00 g/L和822.60 mg/L。单独过表达DGAT基因可能导致代谢通量不平衡，而同时表达乙酰辅酶A羧化酶（ACC1，催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A）基因和DGAT基因可以改善这种不平衡。因此，在YlPDHA021菌株中过表达了ACC1基因，获得工程菌株YlPDHA022。与YlPDHA021菌株相比，工程菌株YlPDHA022的脂质和DHA滴度分别提高了27.1%和35.1%，达到3.82和1111.51 mg/L（图4E）。此外，工程菌株YlPDHA022的生长略有改善。结果表明，途径平衡对DHA生产具有积极影响。

为了进一步提高菌株YlPDHA022的DHA和脂质产量，在5 L生物反应器中进行了补料分批发酵实验。具体而言，在0至24小时添加了17.6 g/L的(NH₄)₂SO₄作为氮源，以实现细胞的快速生长。在发酵过程中，以10 mL/h的固定速率添加800 g/L的葡萄糖。如图5所示，细胞干重在24至72小时内迅速增加，并在192小时时达到97.2 g/L（图5A）。脂质滴度逐渐增加，在192小时时达到最高滴度24.6 g/L（占细胞干重的25.3%）（图5A）。尽管脂质含量相对较低，但与原始菌株Po1f相比，工程菌株YlPDHA022的脂质积累能力已得到极大提升。此外，脂肪酸谱分析显示，DHA在发酵过程中持续合成，最终在192小时时达到总脂肪酸的36.8%，比摇瓶中的含量提高了25.9%（图5B,C）。然而，仍观察到前体脂肪酸PA和LA的积累（图5C）。最终，DHA滴度达到9.06 g/L（图5A），这是迄今为止酵母中报道的最高产量。补料分批发酵实验表明，工程菌株YlPDHA022的脂质合成能力显著增强。然而，仍需要系统测试和优化参数，例如发酵条件和补料时间。未来，可以对碳源、氮源、碳氮比和补料时间等参数进行正交实验，以提高解脂耶罗维亚酵母工程菌株的生产潜力。