期刊：Food Bioscience（IF：5.9）
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.fbio.2026.108352
背景：
急性过量饮酒可导致肝脏乙醇代谢途径超负荷，诱发氧化应激反应、脂质代谢紊乱和肝细胞凋亡级联反应。目前的临床干预多为对症支持治疗，仍缺乏直接在消化道中将乙醇转化为无毒代谢物的有效策略。本研究从鸡肠道内容物样品中分离出凝结芽孢杆菌JF1，并系统评估了其乙醇降解能力和益生菌功能特性。为将凝结芽孢杆菌JF1开发为一种促进体内乙醇代谢的功能性益生菌提供了重要的理论和实验支持。
通讯作者：吕凤霞
主要单位：南京农业大学
引 言
酒精相关肝病（ALD）是全球肝病主要死因之一，其发病与酒精代谢导致的氧化应激、脂质堆积、炎症及肠肝轴紊乱等多重机制相关。目前，市售解酒产品多通过促进肝脏代谢酶活性来加速酒精清除，但效果因个体差异大且不稳定；或仅能延缓而无法阻断酒精吸收，缺乏直接降解乙醇的有效策略。近年来，益生菌因其调节肠道菌群、增强免疫及改善肝功能的潜力，成为干预ALD的研究热点。然而，具有直接乙醇降解能力的益生菌及其护肝机制尚不明确。
凝结芽孢杆菌（Heyndrickxia coagulans）作为一种可形成内生孢子的益生菌，对胃酸、胆汁及乙醇等恶劣环境具有强耐受性，在肠道中易于存活和定植，显示出应用于乙醇相关代谢干预的独特优势。本研究从传统发酵食品及鸡肠道中分离出多株凝结芽孢杆菌，通过系统评估其乙醇降解效率、胃肠耐受性、黏附能力、抗氧化活性、安全性及对肝细胞的保护作用，筛选出高效乙醇降解菌株JF1，并借助全基因组测序解析其功能基因基础，为开发直接降解乙醇、具有肝保护功能的益生菌制剂提供理论依据。
（1）体外乙醇降解效率
从中国传统发酵食品和鸡肠道内容物中回收了总计20株凝结芽孢杆菌分离株。在含有5%乙醇的MRS培养基中培养24小时后，测定了它们的乙醇降解率。如图1A所示，所有菌株均表现出乙醇降解能力，降解率在2.59%至30.26%之间。选择降解率超过25%的菌株DA1、DB4和JF1作为高效乙醇降解的目标菌株。
三种菌株乙醇降解的时间进程分析（图1B）显示，降解率随时间逐渐增加。孵育24小时后，菌株DA1达到最高降解率30.46%。此外，还评估了不同乙醇浓度下的乙醇降解率（图1C）。降解率随乙醇浓度增加而降低。凝结芽孢杆菌JF1在乙醇浓度为2.5%时达到其最大值74.44%。在补充了5%乙醇的MRS培养基中孵育24小时后，三种菌株均表现出良好的乙醇耐受性。到24小时孵育时，它们的OD600值已超过2.0（图1D）。我们还测定了ADH和ALDH的活性（图1E）。结果显示，菌株JF1表现出相对最高的ADH活性（22.62 U/mL），而菌株DA1具有最高的ALDH活性（14.17 U/mL）。
（2）胃肠道模拟测试和Caco-2细胞粘附
鉴于益生菌只有在被运输通过胃肠道并成功在肠道定植后才能发挥其益生作用，候选益生菌需要具备耐受酸性pH条件、胆汁盐和消化酶的能力(Li等, 2023)。三种凝结芽孢杆菌菌株对模拟胃和肠道环境表现出强大的耐受性（图2A）。在模拟胃液中，所有菌株的存活率均高于80%，其中DA1达到最高存活率（85.45%）。在模拟肠液中，两株菌（不包括DA1）的存活率高于70%，其中DB4显示出最高的存活率（74.93%）。这些结果表明，这些菌株能够耐受胃肠道中的胃蛋白酶、胰蛋白酶、低pH值和高胆汁盐条件。
粘附肠上皮细胞对于益生菌定植至关重要(Huang等, 2023)。三种菌株均对Caco-2细胞表现出良好的粘附性（图2B）。共培养3小时后，DB4显示出最高的粘附率（17.94%），其次是JF1（14.74%）和DA1（13.96%）。
（3）疏水性、自聚集和共聚集特性
疏水性有助于益生菌粘附于肠道上皮并形成生物膜。菌株JF1显示出最高的疏水性（62.56%），其次是DB4和DA1（图3A）。自聚集能力确保菌株在肠道中达到高细胞密度，这有利于粘附机制(Zhang等, 2022)。尽管三种菌株之间未观察到统计学差异，但JF1显示出最高的自聚集率（61.17%），其次是DA1和DB4（图3B）。与病原菌的共聚集可以防止病原菌粘附于肠道细胞。菌株DB4在培养4小时后与大肠杆菌AS1.487显示出最高的共聚集率（18.69%），其次是JF1和DA1（图3C）。
（4）抗氧化活性
大量研究表明，益生菌及其代谢物可作为抗氧化剂，从而维持宿主的氧化还原稳态(Li等, 2023)。三种菌株对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子均表现出较强的清除活性，其中CFE的活性高于完整细胞（图4A-C）。菌株JF1具有最高的DPPH清除率（75.92%）、羟基自由基清除率（71.07%）和超氧阴离子清除率（58.78%）。
（5）抗菌活性和安全性评估
抗菌能力对于益生菌调节肠道菌群至关重要。所有三种菌株均能抑制五种食源性病原菌，其中对单核细胞增生李斯特菌的活性最强（图5A）。菌株JF1对所有病原菌的抗菌活性均显著高于其他菌株（p < 0.05）。抗生素敏感性测试显示，所有三种菌株对十种测试的抗生素均敏感，其中DB4的敏感性最高（表S3）。在血琼脂平板上，所有菌株均未表现出溶血活性，与阳性对照金黄色葡萄球菌形成对比，这证实了它们进一步使用的安全性（图5B）。
（6）凝结芽孢杆菌的肝保护活性
MTT法评估了乙醇诱导的HepG2细胞的细胞活力。细胞活力随乙醇浓度增加而降低，选择600 mmol/L乙醇（导致约50%的细胞抑制）用于诱导肝细胞损伤（图6A）。三种凝结芽孢杆菌菌株CFE的干预显著增强了细胞活力，并减轻了乙醇对HepG2细胞的损伤（图6B）。
（7）CFE对HepG2细胞氧化应激和脂质代谢相关基因表达的影响
乙醇代谢会产生氧化应激和有毒副产物，对HepG2细胞造成显著损伤。当我们用凝结芽孢杆菌和乙醇共同处理HepG2细胞时，细胞形态发生改变，如图S2所示。乙醇暴露导致细胞数量显著减少和细胞突起增加。相比之下，用凝结芽孢杆菌处理显著增加了细胞活力，并部分恢复了正常的细胞形态。与这些观察结果一致，乙醇暴露显著上调了氧化应激标志物CYP2E1的表达（2.90倍），并下调了抗氧化酶基因SOD、CAT和GPX的表达（分别降至对照的0.50倍、0.33倍和0.51倍）（图6C-F）。三种凝结芽孢杆菌菌株CFE的干预在不同程度上逆转了这些乙醇诱导的变化，从而减轻了乙醇介导的氧化应激。关于脂质代谢，乙醇处理增加了ACC、FAS和ChREBP的表达水平（分别增加1.58倍、1.32倍和2.40倍），而用三种凝结芽孢杆菌菌株的CFE处理显著抑制了这些脂质代谢相关基因的表达（图6G-I）。
（8）CFE对HepG2细胞炎症、自噬和凋亡相关基因表达的影响
乙醇诱导导致HepG2细胞发生炎症、线粒体损伤、脂肪变性、细胞凋亡和坏死性凋亡等现象，这些过程均受自噬调控。乙醇诱导后，HepG2细胞表现出显著的炎症，表现为促炎细胞因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β的上调。然而，凝结芽孢杆菌CFE的干预显著逆转了TNF-α、IL-8和IL-1β的表达水平，而对IL-6没有观察到统计学显著影响。我们进一步研究了凝结芽孢杆菌CFE对乙醇诱导的HepG2细胞自噬的调节作用。结果显示，与对照组相比，乙醇上调了自噬相关基因（ATG5、ATG7、LC3II、Bnip3）。然而，CFE的干预部分抑制了这些分子的升高表达，从而表明其在减轻过度自噬方面具有保护作用（图7A-D）。乙醇诱导的肝细胞凋亡是ALD发生发展的关键病理过程。研究了凝结芽孢杆菌CFE处理对乙醇诱导的HepG2细胞凋亡相关基因转录水平的影响。如图7E-H所示，乙醇处理的细胞中凋亡相关基因（p53、Bax、caspase-3）显著上调，而CFE下调了这些基因（p < 0.05）。抗凋亡基因Bcl-2被乙醇上调（作为适应性反应），并被CFE进一步上调，但与MD组相比不显著。
（9）凝结芽孢杆菌JF1的全基因组测序
在体外评估了益生菌特性后，我们选择了具有最强乙醇降解能力的凝结芽孢杆菌JF1进行全基因组测序，以获取其功能信息。随后，全基因组测序分析鉴定出一个环状染色体，大小为3,657,992 bp，GC含量为46.22%（图8A）。基因组包含3673个基因，包括3469个蛋白质编码序列（CDS）和77个tRNA基因。通过COG和KEGG数据库进行功能注释显示，在与氨基酸/碳水化合物代谢、能量生产和膜转运相关的通路中富集（图8B和C）。值得注意的是，鉴定出多个编码ADH（adh）和ALDH（adhE）的基因，为其乙醇降解潜力提供了遗传证据（表1）。
研究证明，从中国传统发酵食品和鸡肠道内容物中分离出的凝结芽孢杆菌JF1菌株表现出乙醇降解能力。该菌株表现出强大的胃肠道耐受性、良好的Caco-2粘附性、疏水性、自聚集/共聚集能力和抗氧化活性。该菌株对食源性病原菌具有抑制活性，对十种常见抗生素敏感，并且无溶血活性，从而证实了其生物安全性。在HepG2细胞中，凝结芽孢杆菌JF1减轻了乙醇诱导的氧化应激，调节了脂质代谢、炎症，并调节了自噬、凋亡相关基因的表达。凝结芽孢杆菌JF1的全基因组测序鉴定了其乙醇降解潜力的关键基因（adh, aldh）。总之，凝结芽孢杆菌JF1在开发针对ALD的基于益生菌的干预措施方面展现出有前景的应用潜力。展望未来，凝结芽孢杆菌JF1将在ALD动物模型中进行进一步系统评估，以验证其体内保护功效和安全性，并特别侧重于解析其介导ALD肝保护作用的潜在分子机制。
吕凤霞（通讯作者）
吕凤霞，女，南京农业大学食品科技学院教授，博士生导师，长期从事食品微生物与生物技术、食品酶学、以及酶在农产品深加工与转化中的应用研究，尤其在新型食品用酶的结构与功能、酶分子改造、酶分子克隆、基因表达、工业发酵到后提取及酶的应用等方面开展过大量的研究工作。作为主持人和主要参加人参加国家科技部“十二五”项目、国家“863”、国家自然科学基金和省级科研项目十多项。研究成果“净菜加工流通技术与应用研究”获2006年教育部科技进步二等奖(第六完成人)。近年来，在国内外核心期刊发表论文100多篇，其中被SCI收录70多篇，获发明专利12 项，申请专利4 项，鉴定成果2 项。
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文案：王雨萱
编辑：王雨萱
审核：韩志东
河南科技大学
益生菌科学与技术团队
