背景介绍

AAV作为基因治疗的核心载体，具有免疫原性低、表达稳定、安全性高等优势，在视网膜退行性疾病、帕金森病、肿瘤等多种疾病的治疗中展现出巨大潜力。然而，传统AAV质控方法存在检测耗时、操作复杂、无法实时监测等缺陷—ELISA需2 h且依赖酶标记，qPCR需复杂样品前处理，纳米颗粒追踪分析（NTA）灵敏度不足且重现性差，严重阻碍了AAV产业化进程。超表面等离子体共振（MetaSPR）技术凭借无标记、响应快速等优势，为解决这一难题提供了新路径。本研究通过醛基功能化修饰与双捕获策略优化，进一步提升了传感器的灵敏度、特异性与实用性，实现了AAV生产的全流程监测。

近日，南京师范大学食品与制药工程学院黄丽萍研究员与南京医科大学第一附属医院秦志国博士团队在分析化学领域TOP期刊《Analytical Chemistry》在线发表最新研究成果：“Real-Time, Ultrasensitive, and High-Throughput Monitoring of Adeno-Associated Virus Production via an Aldehyde-Functionalized Dual-Capture MetaSPR Fishing Sensor”。该研究开发了一种创新性的AAV定量监测技术——基于醛基功能化的双捕获MetaSPR高通量与实时过程分析两大互补传感系统，为腺相关病毒（AAV）生产的质量控制提供了快速、无标记、低成本的全新解决方案，破解了基因治疗制造中的关键瓶颈。

研究内容

面对AAV工业生产中实时定量监测的迫切需求，研究团队设计并验证了基于醛基功能化的双捕获MetaSPR生物传感器，开发了两大核心检测平台（图1）。

图1：AAV-2/5病毒颗粒检测的MetaSPR传感器制备及PAT检测原理示意图，含肝素捕获系统、抗体捕获系统及便携式PAT分析装备工作流程。

研究团队通过纳米压印与真空镀膜技术制备了具有周期性纳米杯阵列结构的柔性MetaSPR生物传感芯片，芯片展现出高度一致性（图2）。

图2: MetaSPR传感器的均一性表征与性能验证，通过蔗糖折射率测试证实芯片高灵敏度，IgG特异性结合实验显示线性响应（R²=0.998）。

为提升抗体固定效率与结合特异性，研究团队对芯片进行醛基功能化修饰（ALMetaSPR），经底物试剂筛选、浓度优化及交联条件探索，确定1%聚-L-赖氨酸（PLL）与0.5%戊二醛为最佳组合，芯片可再生42次仍保持稳定性能（图3）。基于ALMetaSPR芯片，团队构建了双捕获策略的96孔高通量检测平台，针对AAV-2设计特异性抗体捕获系统，通过分子垂钓原理特异性捕获目标病毒，与AAV-5、AAV-8无交叉反应，检测限低至1.24×10⁹ GC/mL，与NTA检测结果相关性良好（R²=0.859）（图4）。

图3: ALMetaSPR传感器醛基功能化条件优化示意图及实验结果，明确最佳修饰参数与再生性能。

图4: AAV-2特异性与非特异性检测实验结果，证实传感器高特异性与检测准确性。

同时，利用肝素作为AAV-2天然受体的特性，研究人员开发了通用型捕获体系，解决部分血清型缺乏特异性抗体的难题。该体系对AAV-2的回收率达86.2%-102.3%，可再生10次且检测性能无衰减（图5）。此外，团队将ALMetaSPR芯片与微流控技术、智能手机接口集成，开发了便携式MSPR-PAT实时监测装备。设备含蠕动泵、LED单色光源、光电探测器及芯片卡，通过无菌采样回路直接对接生物反应器，可实时追踪分泌型AAV-5的生产动态，实现病毒浓度可视化监测（图6）。

图5: 肝素介导的AAV-2检测实验示意图及结果，验证肝素捕获系统的特异性、稳定性与再生性。

图6: MSPR-PAT设备结构与实时监测实验结果，展示设备组件、芯片卡设计及AAV-5生产过程动态追踪曲线。

研究证实，传感器表面经温和化学洗脱可重复再生，抗体功能化芯片可再生42次，肝素功能化芯片可再生10次，大幅降低单次检测成本。在实际复杂的细胞上清样品中，该系统对AAV-2的回收率达83.3%-111.4%，能特异性区分不同血清型，有效避免非特异性干扰。垂钓捕获之后可进一步进行AAV空壳率检测。

技术优势与产业化前景

• 超灵敏检测：检测限低至1.24×10⁹ GC/mL，较传统无标记技术灵敏度提升250倍，满足低丰度AAV监测需求。

• 快速高通量：96孔平台15 min完成批量分析，较ELISA提速8倍，适配大规模筛查场景。

• 实时在线监测：便携式设备可直接对接生物反应器，实时追踪AAV生产动态，支持工艺参数即时优化。

• 高稳定性与再生性：芯片再生次数最多达42次，37℃条件下性能稳定，信号衰减可忽略。

• 广泛适用性：双捕获系统适配不同AAV血清型，更换捕获配体后可拓展至其他病毒载体或生物标志物检测。

南京师范大学与牡丹江师范学院联合培养的研究生周翰霖、华中科技大学陈友倩、南京师范大学李彤为论文共同第一作者，通讯作者是南京师范大学黄丽萍研究员和南京医科大学第一附属医院秦志国博士为该论文共同通讯作者。该研究得到华中科技大学刘钢教授和牡丹江师范学院宗宪春教授的大力支持和帮助。本研究得到了国家自然科学基金、广州国家实验室专项基金项目、湖北省重点研发计划项目、江苏省药学会靳培英基金等项目的资金资助。此外，量准公司研发的WeSPR系列分子互作仪为本研究提供了重要的技术支撑。

文章信息

Real-Time, Ultrasensitive, and High-Throughput Monitoring of Adeno-Associated Virus Production via an Aldehyde-Functionalized Dual-Capture MetaSPR Fishing Sensor. Hanlin Zhou, Youqian Chen, Tong Li, Yuhong Li, Jie Li, Yanan Li, Xianchun Zong, Gang Logan Liu, Zhiguo Qin, Liping Huang. Analytical Chemistry. 

DOI: 10.1021/acs.analchem.5c07077

王老师

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