西华大学王周玉&南京大学王乐勇&吉林大学杨柏等人Angew:碳化聚合物点作为生物不相容荧光团成像的通用纳米载体

具有优异发射性能的荧光团往往以牺牲细胞渗透性为代价，这一长期存在的难题在一定程度上限制了其在荧光生物成像中的有效应用。本文报道了一项具有范式转变意义的发现：碳化聚合物点（CPDs）可作为一种通用的非共价转运平台，适用于多种原本无法穿透细胞膜的荧光团。研究始于偶然观察到一种新分子 ——1-（2 - 羟乙基）-5 - 氧代 - 1,2,3,5 - 四氢咪唑并 [1,2-a] 吡啶 - 7 - 羧酸（HECA），它能通过非共价相互作用与碳化聚合物点（CPDs-280）形成稳定且具有细胞渗透性的纳米复合物（负载量约 50.8%）。这一发现促使研究人员展开系统探索，结果表明 CPDs-280 能够显著改变多种细胞器特异性染料的固有靶向信号，将其重新导向细胞质，展现出载体主导的定位机制。该平台的通用性通过递送定制设计的膜不透性两亲性染料（ESY-Na⁺和 ESY）得到了严格验证，这些染料单独使用时无活性，但与 CPDs-280 非共价复合后可产生强烈的细胞内发光。这种强大的、不依赖载体类型的递送能力源于 CPD 表面丰富的正交锚定位点，能够实现多模式结合且无需化学修饰。本研究揭示了一种突破生物屏障的通用策略，为先进生物成像和诊疗学解锁了大量未被充分利用的荧光探针。

二、研究背景

荧光成像技术能够无创、实时地可视化细胞过程，其核心依赖于具有渗透性和高亮度的标记物。目前已有大量荧光分子可用于这一目的，为精准细胞标记提供了巨大潜力。然而，一个根本性难题始终存在：赋予荧光团优异发光性能的分子特征（如扩展共轭结构和刚性芳香骨架），往往会导致这些染料具有疏水性且无法穿透细胞膜，严重限制了其生物实用性。

传统的解决方法包括聚合物包封或繁琐的化学修饰，这些方法不仅使制备过程复杂化，还可能改变荧光团的光物理性质。因此，开发一种无需共价缀合、能够高效转运多种荧光团穿过细胞膜的通用递送平台，成为一项迫切的未满足需求。这类平台将为大量原本生物不相容的荧光探针注入新的活力。

碳化聚合物点（CPDs）近年来已成为极具潜力的纳米载体，其具有独特的核 - 壳结构。碳化核心提供 π- 共轭结构域，可实现 π-π 堆积；聚合物壳层则具有可调的交联度，形成疏水空腔和丰富的官能团，能够通过静电作用和氢键相互作用结合其他分子。然而，目前将小分子负载到 CPDs 上的主流策略仍基于共价缀合，这种方法本质上会损害平台的通用性并使合成过程复杂化。CPDs 作为通用非共价载体的潜力尚未得到充分开发，要实现这一目标，需要在分子水平上理解其表面结构，并刻意构建多个能够容纳多种荧光团的正交结合域。

三、研究内容

研究始于一项偶然发现：1-（2 - 羟乙基）-5 - 氧代 - 1,2,3,5 - 四氢咪唑并 [1,2-a] 吡啶 - 7 - 羧酸（HECA）可通过非共价相互作用轻松锚定在碳化聚合物点（CPDs-280）上，形成稳定的组装体并能顺利进入细胞。该组装体结合了 HECA 优异的量子产率和 CPDs-280 的生物相容性，获得了清晰度极高的细胞图像。受这一高效递送现象的启发，研究人员利用四种结构不同的细胞器靶向染料，系统评估了 CPDs-280 的载体能力。结果令人惊讶，CPDs-280 在所有情况下都能改变染料固有的靶向信号，将所有染料重新导向细胞质，揭示了由载体主导的定位机制。研究人员进一步用定制设计的膜不透性两亲性染料（ESY-Na⁺和 ESY）对 CPDs-280 进行测试，这些染料单独使用时无活性，但与 CPDs-280 形成纳米复合物后，能够进入细胞并产生强烈的细胞内发光。这种强大的、不依赖载体类型的递送能力源于 CPDs-280 表面丰富的正交锚定位点，可实现多模式结合且无需化学修饰。该发现为纳米载体设计带来了范式转变，提供了一种突破生物屏障的通用策略，有助于充分利用大量未被开发的荧光染料，推动先进生物成像和诊疗学的发展。

四、结果讨论

（一）CPDs 与 HECA 的合成及产率特征

柠檬酸（CA）与羟乙基乙二胺（HEEDA）在不同热条件下反应，除生成大量 CPDs 外，还产生了一些小分子。研究人员根据反应温度将所得五种 CPDs 命名为 CPDs-140、CPDs-180、CPDs-220、CPDs-260 和 CPDs-280，并通过透析纯化法分离出 CPDs 和 HECA。产率分析显示，CPDs 的产量随温度升高而逐步增加，而 HECA 的产量则与温度呈负相关，在高温下显著降低，260℃以上时几乎无法从透析液中回收，这表明高温下自由 HECA 会发生热降解，其形成途径也受到抑制。

（二）结构与相互作用分析

通过 ¹H NMR 光谱分析 HECA、CPDs-220 和 CPDs-280 的结构关联发现，CPDs-220 保留了 HECA 的特征质子信号，而 CPDs-280 中这些信号消失，所有尖锐共振峰转变为宽峰，表明 HECA 以非共价锚定的离散实体形式存在于 CPDs-220 结构中，而非共价整合。稳态光谱显示，HECA 的发射与激发无关，而 CPDs-220 则表现出显著的激发波长依赖性，且这种依赖性在 CPDs-140 至 CPDs-280 系列中逐渐增强，与 HECA 含量的减少相关。此外，以 Fe³⁺为探针的研究揭示了不同的荧光猝灭机制：HECA 表现为静态猝灭（寿命恒定，约 14.5 ns），而 CPDs-220 表现为动态猝灭（寿命随浓度降低，从 10.6 ns 降至 5.2 ns），表明 HECA 与 CPDs-220 的非共价锚定建立了高效的能量 / 电子转移途径。

（三）HECA@CPDs-280 组装体的性能与细胞成像

基于 CPDs-280 的 ¹H NMR 信号特征，研究人员推测其存在潜在的对接结构域，并将其用作纳米载体负载 HECA。在温和搅拌条件下，HECA 与 CPDs-280 可自组装形成稳定的 HECA@CPDs-280 复合物，经透析纯化和冷冻干燥后得到稳定粉末。TLC 和 ¹H NMR 验证了负载成功，定量分析显示其负载量高达 50.8%。该组装体保留了 HECA 的高光致发光量子产率（PLQY）和 CPDs-280 的生物相容性（100 μg/mL 浓度下细胞存活率 > 90%），且能高效内化到细胞中。共聚焦显微镜观察显示，仅在 HECA@CPDs-280 处理的 HepG2 细胞中检测到强烈的荧光信号，证实了组装体的成功细胞内化和原位稳定性。而在 200 μg/mL 浓度下，HECA@CPDs-280 使细胞存活率降至 48%，表明其能有效将 HECA 递送至细胞内并产生细胞毒性，为治疗应用提供了潜在可能。

（四）CPDs-280 的载体通用性验证

为评估 CPDs-280 的载体通用性，研究人员选择了四种结构不同的细胞器特异性染料（Lyso-Tracker Red、Mito-Tracker Red、DilC₁₈(3) 和 ER-Tracker Red）进行共组装。结果显示，与 CPDs-280 组装后，所有染料均被重新导向细胞质，打破了其固有的细胞器靶向特性，证实了 CPDs-280 能够递送化学性质多样的载体。此外，研究人员设计了两种结构相似的荧光团（疏水性 ESY 及其羧酸钠衍生物 ESY-Na⁺），它们单独使用时因聚集（ESY）或快速外排（ESY-Na⁺）无法有效成像，但与 CPDs-280 共搅拌后形成稳定复合物（ESY@CPDs-280 负载量约 12.2%，ESY-Na⁺@CPDs-280 负载量约 79.6%），处理细胞 30 分钟后即可检测到强烈的细胞内荧光，表明 CPDs-280 可通过正交非共价相互作用负载疏水和亲水两种类型的荧光团。

（五）组织成像应用

研究人员进一步将 CPDs-280 纳米载体应用于组织荧光成像，用 ESY/ESY-Na⁺、ESY-Na⁺@CPDs-280 和 ESY@CPDs-280 对小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织切片进行染色。结果显示，与对照组相比，CPDs-280 负载的组装体在所有组织类型中均表现出显著增强的荧光信号，且成像均匀性和对比度均有提升，证实 CPDs-280 是复杂生物组织中荧光载体高效递送和精准可视化的优良平台，为体外细胞成像和体外组织病理学分析提供了强大工具。

五、总体结论

本研究揭示了碳化聚合物点（CPDs-280）作为一种具有范式转变意义的纳米载体平台，其利用适应性超分子共组装，能够不受化学性质限制，通用递送多种荧光团。与共价缀合方法不同，CPDs-280 通过正交非共价相互作用，可自发负载从疏水性荧光团（HECA）、细胞器靶向染料到合成两亲性分子（ESY-Na⁺/ESY）等多种染料，打破其固有靶向信号并将其定位于细胞质。该机制解决了荧光团性能与生物相容性之间长期存在的矛盾，其协同突破生物屏障的能力使 CPDs-280 成为未来诊疗学的通用支架，为原本无法递送的生物分子开辟了应用潜力。需要注意的是，该平台的 “通用性” 可能受到一定结构限制（如对超过 CPDs 直径的超大荧光团的适用性），仍需进一步研究。尽管如此，本研究重新定义了纳米载体设计原则，强调 CPDs 的超分子可塑性而非载体特异性工程化，为通用生物医学递送提供了新方向。未来，CPD 基纳米载体的系统设计及其体内生物相容性和代谢命运的详细研究，将是该领域的核心研究方向。

六、图文概览

图 1、a）HECA 和五种 CPDs（CPDs-140～CPDs-280）的制备示意图、产率与反应温度的关系；b）HECA、CPDs-220 和 CPDs-280 的 ¹H NMR 光谱；c）添加 Fe³⁺后 HECA 和 CPDs-220 的平均光致发光寿命；d）添加 Fe³⁺后 HECA 和 CPDs-220 的雅布隆斯基图；

图 2、a）HECA@CPDs-280 的组装过程示意图及细胞成像流程；b）HECA（蓝色）、HECA@CPDs-280（灰色）和 CPDs-280（绿色）的 ¹H NMR 光谱（插图：365 nm 紫外光下的薄层色谱分析，展开剂：正丁醇：水: 冰醋酸 = 3:1:1，体积比）；c）HepG2 细胞与 HECA、CPDs-280 和 HECA@CPDs-280（50 μg/mL，激发波长 = 405 nm，发射波长 = 415-500 nm）孵育后的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，比例尺：10 μm；d）图 c 的光致发光强度；

图 3、a）四种商业细胞器染料（Lyso-Tracker Red、DilC₁₈(3)、Mito-Tracker Red、ER-Tracker Red）的结构；b）染料与 CPDs-280 通过正交非共价相互作用共组装的示意图及组装体（Dyes@CPDs-280）冷冻干燥前后的数码照片；c）染料与 CPDs-280 的逻辑关系图：组装前，游离染料表现出细胞器特异性聚集；形成 Dyes@CPDs-280 组装体后，所有染料均被重新导向细胞质；d）HepG2 细胞与 DilC₁₈(3) 或 Mito-Tracker（50 μg/mL，激发波长 = 561 nm，发射波长 = 580-650 nm）及其组装体处理后的 CLSM 图像，比例尺：10 μm；

图 4、a）与游离 ESY 或 ESY-Na⁺相比，ESY@CPDs-280 细胞摄取增强的推测机制；b）HepG2 细胞与 ESY/ESY-Na⁺、ESY@CPDs-280 和 ESY-Na⁺@CPDs-280（50 μg/mL，激发波长 = 488 nm，发射波长 = 500-650 nm）孵育后的 CLSM 图像，比例尺：10 μm；c）图 b 的光致发光强度；d）用于荧光成像的小鼠组织切片制备流程示意图，包括组织处理、ESY@CPDs-280 染色、组织透明化和 CLSM 荧光成像；e）五种小鼠器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）分别与 ESY/ESY-Na⁺、ESY-Na⁺@CPDs-280 和 ESY@CPDs-280（从上到下，50 μg/mL，激发波长 = 488 nm，发射波长 = 500-650 nm）孵育后的 CLSM 图像，比例尺：50 μm；f）图 e 的光致发光强度；方案 1、a）基于 CPDs 的纳米载体的共价结合方法：将分子负载到 CPDs 上的传统共价修饰策略及当前面临的挑战；b）我们的正交锚定策略：利用 CPDs 独特的核 - 壳结构构建高效纳米载体，实现非共价载体负载，与游离染料相比增强了细胞荧光成像效果，并证实了载体依赖性摄取。

七、作者信息

Feishi Shan, Lijuan Fu, Chengshuang Liao, Jing Zhang, Mingyue Wen, Xiao-Qi Yu, Zhouyu Wang*, Bai Yang*, Leyong Wang*

通讯作者及单位：

1. Zhouyu Wang*:

E-mail: zhouyuwang@mail.xhu.edu.cn

1. Bai Yang*:

E-mail: byangchem@jlu.edu.cn

1. Leyong Wang*: