图4
3.1.3 光片荧光显微镜（LSFM）
LSFM采用正交照明与检测模式，通过选择性平面照明结合宽场读取实现成像，能将光暴露限定在焦平面，具备真正的光学切片能力和高轴向分辨率。
其优势显著，扫描速度快（帧率可达数十至数千帧/秒），光毒性和光漂白极低，成像深度超1000μm，适合大型透明化样本的高分辨率3D成像及动态过程长时程追踪。
该技术已广泛应用于动物模型研究，但在心脏类器官领域应用尚少。已有研究将其与荧光凝集素灌注结合，清晰可视化健康与梗死心脏组织的血管网络，为心血管疾病靶向治疗提供空间分辨数据，未来在中大型成熟心脏类器官的光学切片与3D重建中极具应用前景（图4B）。
3.1.4 高分辨率落射显微镜（HREM）
HREM通过将样本嵌入树脂等可固化介质，经微米级刀片自动连续切片，同步落射照明与图像采集，所获二维图像可直接堆叠成高分辨率3D数据集，无需后续对齐处理。
其优势显著，视野大（可达1 cm³）、分辨率达微米级，且无需组织透明化，适合非透明样本的三维形态与病理研究，还可与多种成像技术联用实现多尺度分析。借助改良的S-HREM技术，已实现人类左心室心脏类器官的全息重建与定量评估。
但该技术存在不足，样本制备可能引发非均匀收缩变形，扫描拼接易产生伪影，且无法进行长时程实时追踪，需与其他技术整合以弥补短板。
3.1.5 透射电镜（TEM）
TEM凭借亚纳米级分辨率，成为评估心脏类器官超微结构成熟度的关键工具。其可清晰观测肌节排列、线粒体成熟度、T管形成等亚细胞结构，揭示类器官在体外培养中逐步贴近原生心肌的结构特征，还能通过对比正常与基因缺陷类器官的超微结构差异，验证特定基因在心肌成熟中的作用。
但TEM存在明显局限，仅能成像超薄切片，无法实现完整3D结构重建，样本制备复杂易引入伪影，且需在真空、固定条件下进行，无法用于活样本或动态过程观测，成像视野狭窄也难以评估类器官整体空间异质性，更适用于静态结构表征而非功能或整体分析（图4D）。
3.1.6 扫描电子显微镜（SEM）
SEM通过高能电子束扫描样本表面并检测反射信号，获取三维形态信息，是观察类器官架构与表型重塑的常用工具，能清晰呈现心脏类器官的外部组织形态和细胞排列特征。
其在心脏类器官研究中已有实际应用，例如可观察到类器官外层心肌细胞紧密黏附、排列有序，还能评估电纺纳米纤维支架对类器官形成的影响，发现心肌细胞会沿支架纤维纵轴均匀分布并呈细长形态，体现出良好的细胞黏附与定向排列效果。但局限性明显，仅能捕捉表面拓扑结构，无法穿透组织观察内部，样本制备过程可能导致细胞表面轻微变形，且仅能提供静态结构信息，无法反映动态功能过程（图4E）。
3.1.7 光学相干层析成像（OCT）
OCT基于低相干干涉原理，利用近红外光散射特性实现无创3D断层成像，无需电离辐射或荧光标记，轴向分辨率达1-15 μm，可清晰勾勒心脏类器官的腔室边界、心肌排列及新生血管。
其优势在于兼具高空间分辨率与实时性，结合扫频或谱域检测技术，能实现每秒数万次线扫描，动态监测类器官跳动收缩。通过与深度学习、M模式成像等结合，可自动分割腔室、量化功能参数，追踪发育过程中形态与收缩功能的成熟变化。但局限性明显，成像深度仅1-2 mm，高分辨率容积成像会产生海量数据，对计算处理能力要求较高（图4F）。
3.1.8 x射线相衬断层扫描（XPCT）
XPCT利用X射线相位信息增强软组织对比度，相较于传统X射线技术，其软组织分辨率更高，且无需造影剂。
该技术可实现无标记、无损的高分辨率3D成像，特别适合观察心脏类器官中细胞与组织分布、血管化及腔室形成等复杂结构。已有研究将其应用于心脏形成类器官成像，成功捕获细胞分布、腔室结构和组织层等详细内部信息，且成像后样本仍可用于后续病理检测。
但目前XPCT在心脏类器官研究中多依赖石蜡包埋的固定样本，活体成像潜力尚未充分开发，且其成像数据的3D重建与后处理流程复杂，常规应用门槛较高。
3.1.9 性能对比
不同心脏类器官结构可视化技术在通量、性能和资源需求上各有取舍。点扫描技术如CLSM和TPM，能提供亚细胞级高空间分辨率，但因串行扫描通量低，且存在成像深度浅、光毒性等问题，不适合大规模药物筛选。
平面/体积成像技术如LSFM和OCT为高吞吐量选择，LSFM可快速对大型复杂类器官进行3D成像，光损伤小，OCT无需标记即可实时监测结构与收缩功能。TEM、SEM、HREM等专用互补技术，能揭示亚细胞超微结构、表面形态或实现全类器官重建，但需固定样本，存在变形风险，且在活体或高含量研究中无通量优势。高吞吐量技术会产生海量数据，依赖AI辅助处理，低吞吐量技术数据集小，后续处理需求低。
3.2 功能表型成像技术
3.2.1 电生理成像
电生理成像技术是评估心脏类器官功能成熟度的关键工具，可实时监测细胞或组织的电信号传导与钙动力学，为疾病建模、药物筛选和再生医学提供支持。
该技术能精准测量类器官发育过程中钙动力学和膜电位变化，如shell-MEA装置可包裹类器官实时记录区域场电位，提升空间分辨率；标准化方案借助MEA和微电极技术，实现场电位与动作电位的定量分析。
在病理模拟中，其可揭示缺血性心脏病、心律失常等机制，“Heart-on-a-Miniscope”平台能高效监测药物诱导的电信号与钙信号变化，为心脏修复研究和 毒性筛选提供可靠数据。
3.2.2 力学成像和力传感
收缩力是反映心脏类器官成熟度与生理相关性的核心功能指标，力学成像与力传感技术是定量评估其收缩功能的关键工具，主要包括原子力显微镜（AFM）、牵引力显微镜（TFM）和布里渊显微镜，广泛应用于2D心肌细胞模型与3D心脏类器官系统。
AFM可通过检测心脏类器官的力学动态区分心律失常亚型，借助悬臂梁捕捉垂直偏转和侧向力信号，结合回归残差方差分析量化收缩同步性，经药物验证可实现高保真心脏毒性筛选。TFM是量化心肌细胞收缩力的金标准，尤其适用于遗传性心血管疾病模型，能通过检测突变心肌细胞的峰值力和位移，揭示基因变异与心肌功能缺陷的关联。
布里渊显微镜则以非接触、无标记优势，通过声子散射量化力学特性，规避了接触式技术对细胞微环境的干扰，为心脏力学研究提供了新方向。
3.2.3 代谢成像
代谢成像是评估心脏类器官功能成熟度的重要手段，聚焦ROS、NADH等关键代谢物的动态变化，反映能量代谢状态，核心技术以拉曼显微镜为代表。
拉曼光谱成像是无标记、无损技术，通过分子振动特征频率识别生物分子，可区分心肌谱系区域，为心脏类器官研究提供化学层面验证，助力解析心脏发育的空间模式与组织分化。
此外，NADH/FAD自发荧光成像等技术，有望实时监测心脏类器官中代谢中间体的积累，评估其对线粒体功能和氧化应激的影响，为探究缺血再灌注损伤等场景下的代谢重编程与组织修复机制提供支持。
3.3 多技术集成与跨技术组合策略
3.3.1 机电耦合与多模态功能评估
在心脏类器官功能评估中，收缩力与机械功能检测和电活动监测同等重要。多模态技术的整合搭建了全面评估平台，可同步捕获电活动与机械功能，深入揭示类器官的机电耦合特性。
Lyu等人设计的柔性超灵敏“力传感膜”，与MEA技术结合，能实时监测类器官的电活动和收缩力，药物处理后可观察到节律场电位时程与收缩力的显著变化，实现机电耦合分析。
Yin等人将电生理成像与机械传感器联用，实时监测动态跳动的心脏类器官，通过关联电活动与收缩力，为研究兴奋-收缩耦合提供新平台，为疾病模型的药物筛选和心脏毒性评估提供有价值的数据支持。
3.3.2 微型心脏集成平台
Heart-on-a-Miniscope是一款紧凑的集成平台，融合长工作距离小型荧光显微镜与芯片心脏技术，整合了光学成像、电刺激和芯片培养功能。
其改良后的小型显微镜空间分辨率达3.3-3.7μm，时间分辨率为60帧/秒，可透过80-120μm玻璃基底对Cal-520染色的类器官进行钙信号成像。PDMS芯片设有七个微孔和平行碳电极，经伊伐布雷定预处理抑制自发收缩后，能实现0.5-2Hz的均匀电起搏。
该系统可量化钙瞬态参数，区分多类药物的心脏毒性，其经济高效的开源设计适用于高通量生理相关药物筛选，且通用性强，可拓展至亚细胞动态成像。
3.3.3 OCT -荧光双模成像系统
OCT-荧光双模态成像系统整合谱域OCT与荧光显微镜，可同步采集人类心脏类器官的3D结构与电生理数据。OCT模块采用850nm激光，轴向和横向分辨率分别达2.1μm和3.9μm，支持实时容积成像；荧光模块共享物镜，以470nm LED激发钙指示剂GCaMP6f获取电生理读数。
该系统通过OCT M模式与钙成像同步获取一致的跳动模式，能检测类器官不同区域的双重频率，动态对比度OCT分析可精准定位具不同频率的跳动簇。其将结构动态与钙信号关联，支持无创体外监测，助力揭示心肌细胞亚型复杂性，为相关研究提供有力技术支撑。
3.4 新兴成像技术及其在心脏类器官中的潜力
除常用成像技术外，多种新兴技术在心脏类器官研究中展现出巨大潜力。光声成像（PAI）融合光学与超声技术，可实时监测血管、血流及血氧水平，已成功应用于3D打印血管网络成像，能量化血氧变化与血栓形成影响，有望用于心脏类器官血管化进程等实时监测。
低相干全息断层扫描（LCH）等新兴无标记模态，经脑、肠道等类器官系统验证，可实现活类器官的长期无标记3D成像，亚细胞分辨率下成像深度达190μm，为心脏类器官研究提供了新的技术方向，具有广阔应用前景。
3.5 成像技术和生物学相关性
先进成像技术是连接其3D结构与动态功能的关键，为疾病建模、药物筛选提供观测手段，更是解析心脏发育、心律失常、缺血损伤等核心机制及免疫-心脏相互作用的重要桥梁。
其中干细胞报告基因成像是基础工具，通过GFP、GCaMP等标记，可实时追踪心肌谱系细胞的分化、空间定位与电生理活动，还能结合微图案化、CRISPR-Cas9等技术，揭示基因调控与结构对收缩功能的影响，为发育毒性筛选提供支撑。
同时，高时空分辨率成像技术可观测心腔形成的细胞自组装过程，钙成像结合报告基因能量化心律失常的钙信号异常，光片荧光显微镜可解析缺血再灌注后的血管重构；ROS响应纳米传感器还能可视化免疫细胞与心肌细胞的相互作用，阐明心脏修复的免疫调控机制。
此外，电生理和多模态功能成像进一步拓展分析维度，结合各类新兴无标记成像技术，构建了结构、功能、代谢、免疫多维度整合的心脏类器官综合评估体系。
