【Nat. Catal.】南京大学黄小强/厦门大学王斌举/深圳先进院周佳海:硫胺素依赖型光生物催化实现不对称C(sp³)–C(sp³)键构建

背景介绍

自由基C(sp³)–C(sp³)键形成是构建富含手性碳中心分子的重要策略，但实现两个前手性烷基自由基的化学选择性与立体选择性重组仍是有机合成领域的重大挑战。传统的Giese型自由基共轭加成反应通常需要双齿配位底物来控制立体化学，且对前手性碳自由基的有效调控较为困难。尽管近年来化学催化在不对称自由基反应方面取得进展，但利用生物催化剂的高选择性与可进化性来解决这一难题，特别是直接利用简单的单齿烯烃底物（如肉桂醛）进行立体选择性自由基偶联，仍具有重要研究价值。

研究思路

本研究设计了一种机制独特的双催化体系，将硫胺素二磷酸(ThDP)依赖型酶与光氧化还原催化协同结合，实现了非天然的光生物催化C(sp³)–C(sp³)键形成。研究团队选择恶臭假单胞菌来源的苯甲酰甲酸脱羧酶(PpBFD)作为蛋白质骨架，通过可见光诱导的单电子转移(SET)过程，将酶促Breslow中间体氧化为持久的β-烯醇自由基(Int. III)，同时光催化剂还原态与烷基自由基前体反应生成另一前手性碳自由基(Int. IV)。两个自由基在酶活性口袋内发生交叉偶联，通过定向进化精确控制立体化学，从而完成传统化学催化难以实现的远程C(sp³)–C(sp³)键不对称构建。

条件优化

研究以肉桂醛(1a)和Katritzky盐(2a)为模型底物、罗丹明B(RhB)为绿色光敏剂，筛选发现野生型PpBFD能以40%产率和67%对映选择性(ee)生成目标产物，且表现出优异的化学选择性（无ipso-加成副产物）。通过多轮定向进化，包括位点饱和突变(SSM)、丙氨酸扫描及聚焦理性迭代位点特异性突变(FRISM)策略，关键突变位点A460、L109、L461和T377被逐步鉴定。最终获得的最优突变体RE1Csp3 (A460G/L109F/T377L)可将产物3a的产率提升至64%，ee值达93%；而针对双立体中心构建的RE4Csp3 (A460G/L109F/T377I/H281F)则实现了89:11的非对映选择性(dr)和91% ee。

底物拓展

该光酶催化体系展现出广泛的底物适用性。对于单一位点构建，多种对位、间位、邻位取代的肉桂醛（含给电子或吸电子基团）以及杂芳基醛均可顺利反应，以27–76%产率和90–96% ee得到相应手性羧酸(3a–3r)。各类苄基Katritzky盐（由伯苄胺制备）也能高效转化(3s–3ab)。在构建连续立体中心方面，利用外消旋二级/三级自由基前体，RE4Csp3可催化生成含β,γ-立体中心的产物(5a–5g)，最高达91:9 dr和95% ee，并成功构建含全碳季碳中心的化合物(5i–5j)。

机理研究

通过蛋白质晶体结构、光谱学实验和理论计算相结合，详细阐明了催化循环机制。晶体结构显示RE1Csp3中L109F和T377L突变使活性口袋从8.0 Å缩小至5.1 Å，增强了手性环境控制。UV-vis光谱证实了酶-底物Breslow中间体(Int. II)的形成；低温EPR检测到酶结合自由基(Int. III)信号；自由基捕获实验(TEMPO)验证了游离烷基自由基(Int. IV)的存在。QM/MM计算表明，Int. IV在活性口袋内采取"向上"(up)和"向下"(down)两种构象，前者通过π-π堆积作用稳定，其C1'–C3偶联能垒(1.9 kcal/mol)显著低于后者(5.5 kcal/mol)，这与实验观察到的(R)构型优势一致，且C(sp³)–C(sp³)路径能垒低于C(sp²)–C(sp³)路径，解释了化学选择性来源。

总结

本研究成功重塑了硫胺素依赖型酶的催化功能，通过协同光氧化还原催化实现了非天然的远程C(sp³)–C(sp³)键不对称构建，为高附加值手性羧酸的合成提供了新途径。该工作不仅拓展了自由基生物催化的反应类型，也证明了通过蛋白质工程可以精确调控两个前手性自由基的立体化学，为发展新型光生物催化体系提供了重要范例。

文献详情

作者：Jianlin Chun, Yuyan Bao, Qiaoyu Zhang, Xueli Hou, Zhouping Wu, Hailong Sun, Zhongqiu Xing, Bin Chen, Zihan Zhang, Yue Zhao, Jiahai Zhou, Binju Wang, Xiaoqiang Huang题目：Enantioselective C(sp³)–C(sp³) bond formation by synergistic thiamine-dependent radical biocatalysis and photoredox catalysis期刊：Nature CatalysisDOI：10.1038/s41929-026-01515-w