期刊：BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS（IF：6.1）
原文链接：https://link.springer.com/article/10.1186/s13068-021-02078
背景：
木质纤维素生物质是石油基原料的一种有吸引力的可持续替代品，可用于生产多种生物基化学品，而预处理通常被认为其生物炼制不可或缺的一步。然而，在木质纤维素预处理过程中不可避免地会产生各种抑制剂，这些抑制剂严重阻碍微生物的生长和发酵。目前，很少有报道称存在一种单一的微生物能够对预处理木质纤维素水解液中的毒性混合物进行脱毒或耐受，同时有效地将糖组分转化为有价值的化合物。作为替代方案，微生物共培养通过将代谢功能分配到不同的特化菌株中，为实现这一目标提供了一种更简单、更有效的方法。
通讯作者：欧阳嘉
主要单位：南京林业大学
引 言
通过微生物发酵从可再生资源生产的生物基化学品，由于化石燃料的枯竭及相关的环境问题，正迅速引起人们的关注[1]。在这些生物基化学品中，乳酸及其衍生物作为日益重要的平台化合物，在食品和化学工业中具有广泛的应用[2]。目前，乳酸的生物法生产技术已非常成熟。然而，传统底物的成本限制了其在聚乳酸作为石油基塑料绿色替代品的大规模开发中的应用[3]。木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，是地球上最丰富、廉价的可再生碳源[4]。实现从木质纤维素来源的糖到乳酸的有效生物转化具有重要意义。然而，由于其顽抗性和不规则的键合结构，很少有微生物能直接利用木质纤维素生产目标产物[5]。因此，预处理对于提高木质纤维素的可消化性并释放更多可发酵糖以供微生物发酵是必不可少的[6]。然而，许多预处理研究表明，在木质纤维素解构过程中不可避免地会形成各种严重阻碍微生物生长和发酵的抑制剂，主要是有机酸、呋喃衍生物和酚类化合物[7]。这些抑制剂构成了有效利用木质纤维素糖和有效生产生物基化学品的严重障碍。因此，开发低成本的方法和微生物来克服生物质发酵中抑制剂的障碍，将有助于木质纤维素生物炼制的规模化和商业化。
（1）高合成菌群产乳酸系统
该图为整个研究的流程示意图。将稀酸预处理后的玉米秸秆水解液（含有三类主要抑制剂：呋喃衍生物、有机酸和酚类化合物）作为底物，构建一个由两株菌组成的合成菌群：工程化的 Pseudomonas putida（敲除了糖代谢路径，无法消耗葡萄糖和木糖）负责降解多种有毒抑制剂，同时保留可发酵糖；Bacillus coagulans 则利用这些糖高效发酵生产 L-乳酸。
(2) 凝结芽孢杆菌在不同浓度未脱毒水解液中的生长（a）与乳酸发酵（b）
该图展示了单独使用 Bacillus coagulans NL01 对不同浓度（20%、30%、40%）未脱毒玉米秸秆水解液的发酵结果。在 20% 水解液中，菌体能够生长并消耗糖，但存在 12 小时的延滞期；而在 30% 和 40% 水解液中，菌体生长和乳酸发酵几乎完全被抑制。这说明 B. coagulans 对抑制剂的耐受能力有限，无法直接用于高浓度水解液的乳酸生产，必须进行脱毒处理。
(3) 恶臭假单胞菌的葡萄糖与木糖代谢路径
该图展示了 Pseudomonas putida KT2440 中葡萄糖和木糖的代谢路径。葡萄糖通过三条路径最终转化为 6-磷酸葡萄糖酸：一是通过 ABC 转运蛋白（gtsABCD）进入胞内并磷酸化；二是通过周质空间 PQQ 依赖的葡萄糖脱氢酶（Gcd）氧化为葡萄糖酸；三是通过 2-酮葡萄糖酸途径。木糖同样被 Gcd 氧化为木糖酸，但不能作为碳源供菌体生长。该图说明了敲除 gcd 和 gtsABCD 可以有效阻断糖的利用。
(4) 野生型与敲除菌株在M9培养基中的生长特性
该图比较了野生型和不同敲除菌株在 M9 基本培养基中对葡萄糖和木糖的利用及生长情况。野生型 P. putida 能在 6 小时内消耗完 5 g/L 葡萄糖，OD₆₀₀ 达到 4.5（图 a），但不能利用木糖生长（图 c）。敲除 gcd 后，葡萄糖消耗显著减慢（图 b），木糖不再被消耗（图 d）。同时敲除 gcd 和 gtsABCD 的工程菌在 4 天内完全不能利用葡萄糖或木糖（图 e、f），成功构建了“不消耗可发酵糖”的脱毒菌株。
(5) 工程菌对有机酸和呋喃醛的耐受性及转化
该图测试了工程 P. putida 对有机酸和呋喃类抑制剂的耐受与转化能力。在以乙酸钠为唯一碳源时，菌体在 0–10 g/L 浓度下均能良好生长，且完全消耗乙酸（图 a、b）。对乙酰丙酸（5 g/L）也能快速利用（图 c、d）。对于 HMF 和糠醛（FAL），工程菌能将其分别转化为毒性较低的 HMFCA 和糠酸，其中 HMF 在 12 小时内完全转化，FAL 在 24 小时内完全转化（图 e、f）。表明该菌对常见抑制剂具有高效降解能力。
（6）工程菌对酚类化合物的代谢能力
该图展示了工程 P. putida 对多种酚类化合物的代谢能力。以约 2 g/L 的单一酚类（如阿魏酸、对香豆酸、4-羟基苯甲酸、香草醛等）为碳源时，菌体能良好生长并快速消耗这些化合物（图 a、b）。对于香草醛和丁香醛，菌体先将其转化为香草酸或丁香酸，香草酸可被进一步利用，而丁香酸不能作为碳源。在混合五种酚酸时，菌体几乎同时消耗它们（图 c）。说明工程菌具有广谱的酚类降解能力。
（7）有无脱毒菌株时水解液中抑制剂浓度的变化对比
该图比较了 30%（v/v）未脱毒玉米秸秆水解液在有无工程 P. putida 处理下抑制剂的变化。有脱毒菌存在时（图 a、c），乙酸和乙酰丙酸在 12 小时内完全降解，HMF 完全转化，总酚含量下降 25%，典型酚类（如阿魏酸、对香豆酸、香草醛、丁香醛等）浓度显著降低。而无脱毒菌的对照组（图 b、d）中，各类抑制剂浓度基本保持不变。证明工程 P. putida 能够在不消耗糖的前提下有效脱除水解液中的多种抑制剂。
（8）两阶段工艺从未脱毒水解液生产乳酸
该图展示了采用两阶段顺序工艺从 30% 未脱毒水解液生产乳酸的最终结果。首先用工程 P. putida 脱毒 24 小时，随后由 B. coagulans 发酵 96 小时。结果表明，脱毒后的水解液中葡萄糖（6.1 g/L）、木糖（约 35 g/L）和阿拉伯糖（4.5 g/L）被有效利用，最终乳酸产量达到 35.8 g/L，产率为 0.8 g/g 总糖。相比之下，未经脱毒的相同浓度水解液无法被 B. coagulans 发酵。该图验证了合成菌群策略在高效产乳酸方面的显著优势。
讨论
本研究构建了一个合成菌群，用于将高毒性的木质纤维素水解液转化为乳酸。该菌群由工程化恶臭假单胞菌（能够消耗和转化抑制剂，同时保留木质纤维素糖供后续发酵）和凝结芽孢杆菌（能够利用可发酵糖产生乳酸）组成。与不产乳酸的单一培养物对未脱毒水解液的发酵相比，微生物共培养从等滴度水解液中产生了35.8 g/L的乳酸，产率为0.8 g/g总糖。本文的结果证实了使用合成菌群将生物功能分配到特定菌株中以完成单一培养难以完成的复杂任务的潜力。
欧阳嘉（通讯作者）
欧阳嘉，女，湖南省湘潭人，1972年11月生，中共党员，教授，研究生导师，教育部新世纪优秀人才，江苏省杰出青年基金获得者，江苏省“333工程”第三层次培养对象、江苏省六大人才高峰人选。现任南京林业大学化工学院生物工程系主任。1994年毕业于江苏石油化工学院，1996年在南京工业大学获得工学硕士学位，毕业后就职于江苏省化工信息中心，2002年进入南京林业大学从教，2007年获得工学博士学位。近年来主持国家自然科学基金、863计划、国家科技支撑计划等国家级和部省级项目14项。在国内外发表学术论文90余篇，其中有33篇已被SCI收录。申请国内外发明专利20件，授权10件。
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文案：张强
编辑：张强
审核：韩志东
河南科技大学
益生菌科学与技术团队
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