PBJ | 南京农大菊花遗传与种质创新团队揭示菊花黑斑病菌致病的分子调控新机制

1. CmNAC29通过激活ABA生物合成限速酶基因CmNCED3，负向调控菊花对A. alternata 的抗性

研究团队首先对前期的转录组测序结果进行了验证，发现CmNAC29的确在A. alternata 侵染过程中持续上调表达。酵母实验显示CmNAC29具有转录自激活活性，且转录激活域位于氨基酸序列的C端。亚细胞定位显示其主要定位于细胞核。进一步对CmNAC29 分别构建超表达和干扰转基因菊花株系，采用菌丝球接种法明确了CmNAC29在菊花黑斑病侵染过程中扮演着感病因子的角色。为深入探究CmNAC29的功能，研究团队对野生型（WT）和amiR-CmNAC29 干扰株系叶片在接种链格孢菌2天后（dpi）及未接种对照组进行了RNA-seq分析。由于CmNAC29具有转录激活功能，通过交叉分析两组比较【WT vs. amiR (Mock)和 WT-In vs. amiR-In（Inoculation）】中的下调表达基因集，最终筛选出938个差异表达基因（DEGs）。通过COG和KEGG数据库对这些DEGs进行功能分类，发现这些DEGs主要富集于“植物激素信号转导”和“类胡萝卜素生物合成”通路。鉴于类胡萝卜素合成中间体是ABA生物合成前体（Chen et al., 2023; Ye et al., 2024），且拟南芥中CmNAC29的同源蛋白NAP/ANAC029已被证实参与ABA合成（Yang et al., 2014），因此重点关注了该通路中的DEGs。值得注意的是，无论在接种病原菌前后，CmNCED3 在WT与干扰株系间均呈现最显著的表达差异，这与既往研究证实NCED3 是介导ABA生物合成和应激反应的关键基因相符（Iuchi et al., 2001; Tan et al., 2003）。因此后续研究选择CmNCED3 作为CmNAC29的候选靶标。进一步通过酵母单杂交、EMSA、ChIP-qPCR以及双荧光素酶报告系统证实了CmNAC29可直接结合CmNCED3启动子中的‘CACG’顺式作用元件，并激活其表达（图1a-f）。对WT与转基因株系的ABA水平进行测定，发现在接种链格孢菌前后，amiR-CmNAC29 干扰株系的ABA含量均显著低于WT（图1g）；相反，OE-CmNAC29 超表达株系在两种条件下均呈现ABA积累升高（图1h）。此外，通过VIGS技术构建的CaLCuV-amiR-CmNCED3 植株对链格孢菌的抗性增强（图1i, j）。为进一步明确ABA在链格孢菌侵染中的作用，研究者在接种前对WT和转基因植株进行ABA喷施预处理。接种2天后，ABA处理的WT植株感病性显著增强，而喷施ABA的amiR-CmNAC29 植株的平均病斑面积与灭菌水处理的WT相当，表明ABA可补偿amiR-CmNAC29 植株的感病性缺失，且CmNAC29介导的菊花对链格孢菌的敏感性依赖于ABA（图1k, l）。OE-CmNAC29 株系经ABA处理后的病斑表型进一步佐证了这一结论（图1m, n）。综上，ABA在菊花中促进A. alternata 侵染，而CmNAC29通过直接激活CmNCED3表达，增强植株体内ABA生物合成。

2. 链格孢菌效应蛋白Aa593靶向定位于植物细胞核的CmNAC29

为深入探究CmNAC29的作用机制，研究者利用A. alternata 侵染的菊花叶片总RNA构建了酵母双杂交文库，并以CmNAC29为诱饵进行筛选。通过NCBI-BLAST比对和烟草瞬时表达系统，发现效应蛋白CC77DRAFT_360593（Aa593）能够诱导Nicotiana benthamiana 的叶片细胞死亡。生物信息学分析显示，Aa593不含跨膜结构，无糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定位点、线粒体定位信号及保守结构域，但在其N端1-17位氨基酸残基存在信号肽（SP）序列。这些特征表明Aa593是一种新型、功能未知的效应蛋白，值得深入研究。进一步通过荧光素酶互补成像（LCI）、双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）及GST pull-down实验证实了Aa593与CmNAC29在植物细胞核内存在物理相互作用（图2）。

3. Aa593作为毒性效应蛋白发挥功能

研究发现，与接种初期（0 hpi）相比，Aa593在接种后6h表达量显著上调（图3a），表明该效应蛋白可能在病原菌侵染过程中发挥应答功能。进一步通过酵母外泌和TTC实验证明了Aa593的信号肽功能（图3b）。为直观展示Aa593从A. alternata分泌并转运至植物细胞，研究者构建了含有pAa593::Aa593-GFP的菌株，并将其菌丝悬浮液注射到菊花叶片中（图3c）。接种24h后，在叶片细胞的细胞核及其他亚细胞结构中均观察到绿色荧光信号（图3d）。且在本氏烟中的亚细胞定位显示全长Aa593与缺失信号肽的Aa593-ΔSP蛋白均分布于整个烟草细胞（图3e）。这些结果证实Aa593可被A. alternata分泌并递送至植物细胞内。此外，研究者分别用烟草瞬时转化系统和原核诱导表达获得的重组蛋白处理烟草和菊花叶片，发现Aa593能够诱发植物强烈的细胞死亡（图3f, g）。值得关注的是，与对照组相比，在接种重组蛋白Aa593-His的菊花叶片中，防御相关基因表达均呈现下调趋势，暗示着Aa593进入植物细胞后能够抑制免疫防御反应。研究者进一步分别构建了ΔAa593缺失突变体和回补菌株，接菌结果揭示了Aa593对A. alternata全毒力的贡献，且在菊花、烟草、拟南芥中超表达Aa593均能促进A. alternata的侵染和定殖。以上结果说明Aa593作为一种毒性效应因子，削弱植物的免疫防御系统。

4. Aa593通过劫持CmNAC29-CmNCED3分子模块促进A. alternata侵染

上述结果表明，Aa593通过CmNAC29介导的调控通路发挥其毒性功能。为验证此推断，研究者分析了野生型与OE-Aa593菊花株系中CmNCED3的表达情况和ABA激素水平。与WT相比，OE-Aa593植株中CmNCED3表达显著上调（图4a），且内源ABA水平显著升高（图4b），暗示Aa593与CmNCED3之间存在着调控关系。但酵母单杂交实验发现Aa593不能直接结合CmNCED3的启动子（图4c），表明其可能通过间接方式调控CmNCED3的表达。进一步通过菊花原生质体瞬时表达实验发现，当p35S::CmNAC29与p35S::Aa593共表达时，LUC/REN比值较单独表达p35S::CmNAC29显著增大（图4d，e），证明Aa593能增强CmNAC29对下游基因CmNCED3的转录激活能力。研究者借助GAL4-BD系统和EMSA实验证明Aa593的表达增强了CmNAC29的转录激活能力，但不改变其DNA结合能力（图4f-h）。为了验证ABA是否能够补偿ΔAa593突变体的毒性缺失，研究者在接种F20-WT或ΔAa593突变体前对菊花进行了ABA预处理。接种2天后，外源ABA预处理使F20-WT和ΔAa593突变体侵染的叶片均呈现更严重的病斑，且ABA预处理的ΔAa593接种组病斑严重程度与灭菌水预处理的F20-WT接种组相当（图4i, j），表明外源ABA可恢复ΔAa593突变体的毒性缺陷。通过RT-qPCR检测发现，与F20-WT接种相比，ΔAa593突变体接种的菊花叶片中CmNAC29的转录水平与ABA含量均较低。且在WT和amiR-CmNAC29干扰植株原生质体中的瞬时转化实验和接菌实验结果表明Aa593对CmNCED3转录的调控部分依赖于CmNAC29。在OE-Aa593植株中瞬时干扰CmNAC29表达后接种A. alternata，结果显示敲低CmNAC29表达能够抑制Aa593介导的致病性。以上结果揭示了Aa539利用CmNAC29介导的ABA合成路径促进了A. alternata的侵染。

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