南京农业大学科研团队在 PNAS(Q1/9.1) 发文!揭示 D - 氨基酸转氨酶 OsDAAT1 调控水稻垩白形成的全新分子机制
水稻垩白是制约稻米外观品质与商品价值的关键难题，垩白粒碾磨易碎、食味变差，是水稻优质育种亟待攻克的重要性状。目前已克隆的水稻垩白主效基因数量有限，自然变异调控垩白发生的分子通路仍存在大量研究空白。D 型氨基酸在动植物、微生物中具备多样生理功能，但植物体内 D - 氨基酸代谢调控籽粒发育与品质的作用长期不明确。本研究由国内多单位联合攻关，在国际顶尖期刊PNAS发表研究成果，阐明水稻 D - 氨基酸转氨酶基因OsDAAT1通过母体调控模式、D - 氨基酸稳态、蛋白异构化与内质网应激级联反应决定籽粒垩白形成，同时挖掘到低垩白优异单倍型，为水稻优质分子育种提供关键靶标与理论支撑。
通讯作者及单位、邮箱Gongyu Li：ligongyu@nankai.edu.cn；Yihua Wang：yihuawang@njau.edu.cn；Jianmin Wan：wanjm@njau.edu.cnState Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement and Utilization, Zhongshan Biological Breeding Laboratory, Jiangsu Nanjing Rice Germplasm Resources National Field Observation and Research Station, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;Tianjin Key Laboratory of Biosensing and Molecular Recognition, Research Center for Analytical Science, Frontiers Science Center for New Organic Matter, College of Chemistry, Nankai University, Tianjin 300071, China;College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;State Key Laboratory of Crop Gene Resources and Breeding, National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
核心内容结果 1：图位克隆锁定母体效应垩白关键基因 OsDAAT1。研究从日本晴组培突变体库筛选获得高腹白突变体daat1，该突变体垩白率、垩白度显著上升，灌浆速率、千粒重下降，株高、分蘖、结实率等农艺性状同步劣变，籽粒淀粉、直链淀粉和贮藏蛋白含量显著降低。正反交试验证实该基因控制垩白为母体孢子体遗传模式，只有母本为纯合突变基因型时子代籽粒才表现垩白；利用 F₂分离群体将候选基因精细定位在 3 号染色体 48kb 区间，测序发现突变体存在大片段缺失，导致 LOC_Os03g24460 编码序列破坏。互补转基因、CRISPR 敲除、等位突变材料共同验证该基因为垩白控制基因OsDAAT1；组织特异性 RNAi 试验证明，营养体组成型沉默基因出现垩白，胚乳专一沉默无垩白，明确OsDAAT1依托母体组织而非胚乳行使垩白调控功能。结果 2：OsDAAT1 编码胞质定位广谱 D - 氨基酸转氨酶，基因突变打破 D - 丙氨酸体内稳态。基因表达模式显示OsDAAT1主要在水稻节部维管组织高表达，蛋白定位于细胞质；体外酶活试验证实 OsDAAT1 是广谱 D - 氨基酸转氨酶，可实现 D-Ala、D-Glu、D-Ser、D-Met 之间的氨基转移互变。内源氨基酸定量检测表明，OsDAAT1突变后水稻茎秆、节间与发育籽粒中 D - 丙氨酸（D-Ala）大量累积、D - 丝氨酸（D-Ser）含量下降，叶片两种 D - 氨基酸无明显变化，互补株系可回补氨基酸失衡表型，证明 OsDAAT1 是维持水稻母体器官 D-Ala 稳态的核心功能蛋白。结果 3：D - 氨基酸异常积累改变蛋白异构水平，诱发籽粒发育关键阶段内质网应激。9DAF 发育籽粒转录组测序显示，daat1突变体内质网加工、碳代谢、淀粉合成通路基因大范围差异表达，内质网应激标志基因显著上调；蛋白免疫印迹与透射电镜证实突变体内质网分子伴侣蛋白富集、内质网细胞器肿胀畸形。外源喷施 D-Ala、D-Ser 可直接诱导野生型水稻幼苗和灌浆籽粒内质网应激基因上调。依托立体蛋白质组学技术发现，水稻籽粒天然存在含 D 型氨基酸的异构多肽；daat1突变后谷蛋白、储藏蛋白、蛋白二硫键异构酶（PDI）等关键储藏相关蛋白的肽段异构修饰发生显著改变，破坏蛋白正常折叠加工，最终触发持续性内质网胁迫。结果 4：启动子区自然变异形成优异单倍型 Hap1，在水稻驯化中被人工正向选择。利用 536 份水稻种质开展基因自然变异分析，OsDAAT1启动子区 7 个 SNP 分化形成两种单倍型：Hap1为低垩白优良单倍型，Hap2高垩白；双荧光素酶试验证明Hap1启动子转录活性更强，种质中携带Hap1的材料基因表达量更高。以 9311（Hap1）为背景导入 Hap2 染色体片段后，株系籽粒垩白率显著上升。野生稻、地方种和现代栽培稻单倍型演化分析表明，Hap1在水稻驯化与育种进程中被持续人工选择，现代栽培稻中占比接近 100%；群体分化系数 Fst、核苷酸多样性 π 数据佐证OsDAAT1经历驯化选择瓶颈。
图解图 1：突变体表型鉴定与 OsDAAT1 图位克隆。展示野生型与daat1突变体糙米外观、垩白率、垩白度、千粒重表型数据；基因精细定位区间、突变体大片段缺失位置、PCR 鉴定电泳结果；互补转基因、组成型 RNAi、胚乳特异 RNAi 株系籽粒表型与基因表达量，直观证明基因母体调控垩白的遗传特征。图 2：OsDAAT1 表达定位、酶活功能与体内 D - 氨基酸含量测定。包含基因不同组织时空表达、节部原位杂交定位、蛋白亚细胞定位与细胞器组分分离结果；OsDAAT1 催化 D - 氨基酸转氨反应原理图与体外酶活检测数据；野生型、突变体、互补株系叶片、茎节、籽粒 D-Ala 定量结果，明确酶功能缺失直接造成 D-Ala 富集。图 3：OsDAAT1 突变诱发水稻胚乳内质网应激。呈现转录组 KEGG 通路富集结果、内质网应激基因 qPCR 定量、内质网伴侣蛋白免疫印迹；胚乳细胞内质网透射电镜显微结构；外源 D - 氨基酸处理后野生型籽粒应激基因表达变化，串联 D - 氨基酸累积与内质网损伤的因果关系。图 4：立体蛋白质组解析突变体蛋白异构化差异。列出籽粒蛋白提取与立体蛋白组试验流程；野生型、突变体、互补系总蛋白 / 异构蛋白韦恩图；差异异构肽段火山图、储藏蛋白相关异构修饰热图、样本 PCA 聚类，证实基因突变扰动关键储藏蛋白立体异构修饰。图 5：OsDAAT1 单倍型分化、功能验证与驯化演化。标注启动子关键变异位点及 Hap1/Hap2 单倍型分型；两类单倍型种质垩白表型、启动子活性、基因表达对比；9311 导入 Hap2 渐渗系表型；野生稻 - 地方种 - 现代品种单倍型占比演化柱状图，体现人工驯化选择痕迹。
展望育种应用：本研究挖掘的OsDAAT1<sup>Hap1</sup>优异单倍型可作为分子育种功能标记，利用分子标记辅助育种快速改良主栽籼粳稻品种垩白缺陷，助力优质稻新品种选育。基础研究拓展：依托本研究建立的水稻立体蛋白组检测体系，继续挖掘作物中 D - 氨基酸介导蛋白异构调控品质的新基因，完善植物 D - 氨基酸代谢调控网络。抗逆与品质协同改良：围绕 D - 氨基酸 - 内质网应激通路，探究高温等逆境通过扰动 D - 氨基酸稳态加剧垩白的机理，创制耐高温、低垩白双优水稻新材料。
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