南京医科大学联合哈尔滨医科大学发表38.7分研究:PKM2 S-亚硝基化通过凝溶胶蛋白依赖的线粒体分裂驱动心脏纤维化并揭示米他匹伐治疗潜力
心脏纤维化是高血压、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病不良预后的核心决定因素，目前临床仍缺乏直接靶向成纤维细胞的有效治疗策略。南京医科大学联合哈尔滨医科大学在国际顶级心血管期刊《Circulation》发表突破性研究，首次阐明丙酮酸激酶 M2（PKM2）的 S - 亚硝基化修饰在心脏纤维化中的关键调控机制。研究发现，心力衰竭患者及动物模型的心脏成纤维细胞中，PKM2 在半胱氨酸 49 和 326 位点发生特异性 S - 亚硝基化，该修饰通过破坏 PKM2 与凝溶胶蛋白的相互作用，促进 DRP1 线粒体转位引发过度线粒体分裂，最终驱动成纤维细胞活化与纤维化进展。尤为重要的是，美国 FDA 已批准的罕见血液病药物米他匹伐可通过激活 PKM2 有效预防并逆转心脏纤维化，为临床抗纤维化治疗提供了极具转化价值的候选药物。
心脏纤维化是几乎所有心血管疾病共同的病理特征，其核心是心脏成纤维细胞异常活化并过度分泌细胞外基质，最终导致心脏结构重塑和功能进行性恶化，是心血管疾病死亡的主要原因之一。目前临床尚无直接靶向成纤维细胞的特异性抗纤维化药物，标准治疗仅能延缓疾病进展而无法逆转已形成的纤维化损伤，因此亟需探索新的治疗靶点和策略。S - 亚硝基化（SNO）是一氧化氮介导的重要蛋白质翻译后修饰，通过调控蛋白质的构象、活性和相互作用参与多种生理和病理过程。近年研究发现，成纤维细胞即使在静息状态下也具有高代谢活性，线粒体功能异常与心脏纤维化进展密切相关，但翻译后修饰如何通过调控代谢和线粒体动力学介导成纤维细胞活化仍不清楚。丙酮酸激酶 M2（PKM2）是糖酵解的关键限速酶，特异性高表达于心脏成纤维细胞，其活性受四聚化状态动态调控。然而，PKM2 的翻译后修饰及其在心脏纤维化中的病理生理作用尚未见报道，本研究旨在填补这一空白，为心脏纤维化的治疗提供新的理论基础和候选药物。
本研究采用临床样本 - 动物模型 - 细胞分子 - 药物转化的系统性研究思路，层层深入阐明 SNO-PKM2 在心脏纤维化中的作用及分子机制。首先，通过 S - 亚硝基化蛋白质组学技术分析 TAC 小鼠和自发性高血压大鼠心脏组织，筛选出在心脏纤维化中显著升高的 SNO-PKM2，并在心力衰竭患者心脏组织中验证其表达水平，建立临床相关性。随后通过液相色谱 - 串联质谱鉴定出 PKM2 发生 S - 亚硝基化的特异性位点为 Cys49 和 Cys326，构建 S - 亚硝基化抵抗型突变体，在细胞水平验证该修饰对 PKM2 酶活性、四聚化状态及成纤维细胞活化的影响。在此基础上，构建心脏成纤维细胞特异性 PKM2 条件性敲除小鼠，结合 AAV9 介导的野生型和突变型 PKM2 回补实验，在体内明确 SNO-PKM2 对心脏纤维化的调控作用。进一步通过无偏蛋白质组学、免疫共沉淀联合质谱及一系列分子生物学技术，揭示 SNO-PKM2 通过破坏与凝溶胶蛋白的相互作用，促进 DRP1 线粒体转位和过度线粒体分裂的分子机制。最后，筛选并验证 FDA 已批准的 PKM2 激活剂米他匹伐的抗纤维化作用，完成从基础研究到临床转化的衔接。
本研究首次发现，心力衰竭患者及 TAC、Ang II 诱导的心脏纤维化动物模型中，心脏成纤维细胞内 PKM2 在 Cys49 和 Cys326 位点发生显著的 S - 亚硝基化修饰，该修饰由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导。SNO-PKM2 可降低 PKM2 的酶活性并抑制其四聚化，一方面导致糖酵解最后一步受阻，磷酸戊糖途径代偿性激活，为成纤维细胞活化提供生物合成原料；另一方面破坏 PKM2 与凝溶胶蛋白的相互作用，释放游离的凝溶胶蛋白并促进其线粒体转位。凝溶胶蛋白在线粒体外膜上招募 CaMKII 激酶，介导 DRP1 Ser616 磷酸化及其线粒体转位，引发过度线粒体分裂和功能障碍，最终驱动成纤维细胞向肌成纤维细胞分化及心脏纤维化进展。体内功能实验证实，心脏成纤维细胞特异性 PKM2 敲除会加重 TAC 诱导的心脏纤维化，而回补 S - 亚硝基化抵抗型 PKM2 可显著改善心功能并减轻纤维化。尤为重要的是，美国 FDA 已批准用于治疗丙酮酸激酶缺乏症的药物米他匹伐，可呈剂量依赖性地恢复 PKM2 活性和四聚化状态，抑制线粒体分裂，不仅能预防心脏纤维化的发生，还能逆转已建立的纤维化病变，且在实验剂量下无明显肝肾毒性。
Figure1 心脏纤维化过程中 PKM2 的 S - 亚硝基化水平升高对主动脉缩窄（TAC）小鼠和自发性高血压大鼠心脏组织进行 S - 亚硝基化蛋白质组学分析，鉴定出 54 个重叠的 S - 亚硝基化蛋白，KEGG 富集显示糖酵解和线粒体氧化磷酸化通路显著富集；证实 PKM2 特异性高表达于心脏成纤维细胞，在成年小鼠心肌细胞中几乎不表达；心力衰竭患者、TAC 小鼠、自发性高血压大鼠心脏组织中 SNO-PKM2 水平显著升高；血管紧张素 II（Ang II）刺激可诱导多种成纤维细胞中 SNO-PKM2 升高，NO 供体可直接增加 SNO-PKM2 水平，证实 NO 是其修饰来源。
Figure2 心脏成纤维细胞特异性 PKM2 敲除加重 TAC 诱导的心脏肥大和纤维化构建他莫昔芬诱导的心脏成纤维细胞特异性 PKM2 条件性敲除（cKO）小鼠并完成 TAC 造模；cKO 小鼠 TAC 术后心功能显著恶化，表现为射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）降低、E/E' 比值升高；cKO 小鼠心脏重量指数显著增加，心肌细胞肥大明显，肥大相关基因（Anp、Bnp、β-Mhc）表达上调；cKO 小鼠心脏组织中纤维化相关基因（Col1a1）及蛋白（α-SMA、I 型胶原）表达显著升高，间质胶原沉积明显增加。
Figure3 SNO-PKM2 驱动 TAC 小鼠心脏肥大和纤维化构建携带成纤维细胞特异性 Postn 启动子的 AAV9 载体，分别表达野生型（WT）和 S - 亚硝基化抵抗型（Cys49/326S，MUT）PKM2；转染 MUT PKM2 可显著改善 TAC 诱导的心功能障碍，降低心脏重量指数，抑制心肌细胞肥大；MUT PKM2 转染可显著降低心脏组织中 SNO-PKM2 水平，抑制纤维化相关基因和蛋白表达，减少间质胶原沉积；上述保护作用在 Ang II 诱导的心脏纤维化模型中得到一致验证。
Figure4 SNO-PKM2 诱导 6 - 磷酸葡萄糖酸积累并损伤线粒体功能Ang II 刺激导致成纤维细胞糖酵解受阻，磷酸戊糖途径激活，6 - 磷酸葡萄糖酸和 NADPH/NADP + 比值升高，PKM2 激活剂 TEPP-46 可逆转该代谢重编程；抑制葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶（G6PD）可阻断 Ang II 诱导的成纤维细胞活化；Ang II 刺激损伤成纤维细胞线粒体呼吸功能，增加线粒体活性氧产生，降低线粒体膜电位和 NAD+/NADH 比值；TEPP-46 预处理可恢复线粒体功能，转染 MUT 而非 WT PKM2 可显著改善 PKM2 敲除细胞的线粒体功能障碍。
Figure5 SNO-PKM2 驱动过度线粒体分裂并诱导线粒体自噬Ang II 刺激导致成纤维细胞线粒体碎片化增加，线粒体面积减小、圆形度升高，转染 MUT PKM2 可抑制线粒体分裂；Ang II 促进 DRP1 Ser616 磷酸化及其线粒体转位，线粒体融合相关蛋白表达无明显变化；Ang II 诱导线粒体自噬增强，表现为 Parkin、PINK1 表达升高，LC3 与线粒体共定位增加；线粒体分裂抑制剂 Mdivi-1 可阻断 Ang II 诱导的成纤维细胞活化，TEPP-46 可抑制 DRP1 磷酸化和线粒体自噬。
Figure6 SNO-PKM2 通过凝溶胶蛋白（GSN）依赖的方式介导线粒体 DRP1 转位免疫共沉淀联合质谱鉴定出 PKM2 的关键相互作用蛋白 GSN，Ang II 刺激可显著降低 PKM2 与 GSN 的相互作用；心力衰竭患者心脏组织中 PKM2 与 GSN 的相互作用同样降低；确定 PKM2 与 GSN 的相互作用区域：PKM2 的 1-116 和 218-389 位氨基酸，GSN 的 G3 和 G4-G6 结构域；Ang II 刺激增强 GSN 与 DRP1 的相互作用及 GSN 的线粒体转位，敲低 GSN 可显著抑制 DRP1 线粒体转位；GSN 通过招募 CaMKII 促进 DRP1 Ser616 磷酸化。
Figure7 GSN 缺失通过抑制线粒体分裂减轻心脏纤维化敲低 GSN 可显著恢复 Ang II 诱导的成纤维细胞线粒体形态异常，改善线粒体功能障碍；GSN 敲低可抑制 Ang II 诱导的成纤维细胞活化，降低纤维化相关基因和蛋白表达；TEPP-46 可恢复 PKM2 与 GSN 的相互作用，阻断 GSN 与 DRP1 的结合及 GSN 的线粒体转位；成纤维细胞特异性 GSN 敲低可显著减轻 TAC 和 Ang II 诱导的心脏肥大、纤维化及心功能障碍。
Figure8 米他匹伐预处理呈剂量依赖性减轻 TAC 诱导的心脏纤维化和心力衰竭且副作用少TAC 术后立即给予不同剂量米他匹伐灌胃，中、高剂量可显著降低心脏重量指数，改善心功能；米他匹伐呈剂量依赖性增加心脏组织 PK 活性，抑制纤维化相关基因和蛋白表达，减少间质胶原沉积；组织病理学检查显示米他匹伐对肝、肺、肾无明显毒性作用；米他匹伐对 Ang II 诱导的心脏纤维化同样具有显著保护作用，且可逆转已建立的心脏纤维化。
本研究首次揭示了 PKM2 S - 亚硝基化修饰在心脏纤维化中的关键调控作用，建立了 “翻译后修饰 - 代谢重编程 - 线粒体动力学 - 成纤维细胞活化” 的全新调控轴，为理解心脏纤维化的分子机制提供了重要的新视角。研究发现 FDA 已批准药物米他匹伐具有显著的抗心脏纤维化作用，实现了从基础研究到临床转化的快速衔接，为心脏纤维化的治疗提供了极具潜力的候选药物，有望缩短新药研发周期，具有重要的临床应用价值和社会意义。同时，本研究也存在一定局限性：首先，研究主要在压力超负荷诱导的心脏纤维化模型中验证了 SNO-PKM2/GSN/DRP1 通路的作用，该通路在心肌梗死后修复性纤维化中的功能仍需进一步研究；其次，未构建 S - 亚硝基化模拟型 PKM2 突变体来直接验证该修饰的促纤维化作用；最后，本研究仅使用雄性小鼠进行实验，而性别差异会显著影响压力超负荷的心脏反应，该通路在雌性小鼠中的作用及性别特异性调控机制有待后续深入探讨。
参考文献
Luo S, Ye D, Zhang Y, Wang Y, Zhou M, Lv M, Wang X, Zhong K, Zhang Y, Hu L, Sun S, Zhang Z, Yu B, Sun C, Kong X, Huang Z, Chen X, Han Y, Xie L, Ji Y. S-Nitrosylation of Pyruvate Kinase Isoform 2 Drives Cardiac Fibrosis by Promoting Mitochondrial Fission. Circulation. 2026 Feb 3;153(5):338-357. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.125.075903. Epub 2025 Dec 10. PMID: 41368700.
