人工酶旨在融合生物催化的高选择性、可进化性与化学催化多样的反应活性，而将非天然催化基团整合到蛋白骨架中是领域核心难题。目前主流有两种技术路线：一是嵌入功能化非天然氨基酸，但该方法需配套专属正交翻译系统，还会导致蛋白表达量下降，不利于规模化；二是引入人工辅因子，依靠共价连接、金属配位或超分子作用结合蛋白，却普遍存在结合方式有限、特异性弱、适配骨架少等缺陷。因此，开发操作简单、普适性强、便于定向进化优化的辅因子体系，是提升人工酶平台实用性的关键。
近日，南京大学潘惠杰课题组在Angewandte Chemie International Edition上发表研究，开发出一款全新NAD⁺型人工辅因子，成功改造广泛存在的NAD(P)⁺结合蛋白，使其具备全新的亚胺离子催化能力，该策略核心思路是基于该本课题组前期开发了一种光活性辅因子BpAD（二苯甲酮腺嘌呤二核苷酸），该NAD+类似物通过将烟酰胺基团替换为光敏剂实现功能改造。BpAD的引入可有效地将多种NAD+结合蛋白重塑为人工光酶，这些人工光酶可通过能量转移机制实现[2 + 2]环加成反应（Nat. Catal., 2025, 8, 822）。随后通过对BpAD进行修饰改造，开发了新型光活性辅因子MeO-BpAD，成功实现了对映选择性的分子间[2π + 2σ]环加成反应（J. Am. Chem. Soc. 2026, 148, 13755）。基于这一研究思路，研究团队现拓展烟酰胺腺嘌呤二核苷酸型辅因子的催化应用范围，通过将烟酰胺部位替换成具有催化活性的苯胺，开发了一种新的辅因子AnAD，成功将天然的氧化还原酶重编程为亚胺离子人工酶，在生物催化领域首次实现了非天然的串联Friedel-Crafts烷基化-对映选择性质子化反应（图1）。
图1 基于NAD⁺构建的人工酶
研究团队使用富电子芳烃2a与甲基丙烯醛1a作为模板反应，测试了由多种野生型NAD(P)+依赖性蛋白组成的支架库，实验结果表明，不同来源的蛋白支架兼具宽泛的本征兼容性，同时在催化活性与立体选择性上呈现出显著差异。其中，结核分枝杆菌来源的脱氢酶变体fabG3展现出最优的初始催化性能（67%产率，68% ee）。后续对照实验进一步验证，单一的辅助因子AnAD或野生型蛋白支架均无法实现高效的立体控制，只有二者协同组装形成的全酶体系后，才能高效诱导高立体选择性的催化转化。这一结果充分证实，人工辅助因子与蛋白微环境的协同作用，对体系催化活性与手性诱导效果起到了决定性调控作用。
表1 反应条件优化与蛋白改造
为了进一步优化该催化体系，研究团队通过分子对接技术将1a和AnAD形成的亚胺中间体对接至fabG3活性位点中（PDB: 1NFQ）。结构模型显示，AnAD的结合模式与天然辅酶高度一致，其苯胺单元精准地指伸入了底物结合口袋（如图2a所示）。基于该结构模型的指导，研究团队对距离中间体5Å以内的关键氨基酸位点进行定向进化。通过三轮进化改造，最终成功筛选出了两个最优突变体（fabG3-T191Q-L92I-1198L与fabG3-T191Q-L92I-1198F），将两类反应底物的化学产率和对映选择性分别最高提升至98%和93% ee以及80%和93% ee（如表1所示）。值得一提的是，该进化改造后的蛋白在未添加AnAD辅因子时，依旧表现出良好的催化性能，产物收率49%，对映体过量值达88%。这说明氨基酸突变重塑了活性口袋的空间结构，有效优化了底物的结合方式与空间取向。此外，该全酶体系展现出了优异的有机溶剂耐受性，在高达30% v/v的DMSO共溶剂存在下依然能保持极高的催化活性。
图2 蛋白的结构建模与定向进化
在最优反应条件下，对底物适用性进行考察，小体积二烷基氨基取代底物的反应收率普遍较高(3b-3c)；当取代基由二甲氨基依次替换为哌啶基、空间位阻持续增加时，反应收率呈梯度下降，但对映选择性几乎不受影响(3b–3e)。苄胺基取代则会导致收率大幅降低，主要归因于其给电子能力较弱，致使芳烃C4位亲核活性显著下降。而烯醛底物的空间位阻耐受性有限，将α位取代基由甲基替换为乙基（3h）后，反应活性下降，对映选择性也略有降低；而引入体积更大的苄基（3i）时，产物收率与立体选择性均大幅下降。若将烯醛底物1替换为结构相近的甲基乙烯基酮，则完全没有反应活性，这大概率是因为酮类底物形成相应亚胺离子中间体的能力有所下降。对于吲哚类底物，无论其芳环带有给电子基团还是吸电子基团，反应均可顺利进行（5b–5e）。研究表明，2-甲基基团发挥着关键作用，主要归因于其可显著增强吲哚C3位的亲核活性；若移除该基团，反应转化率将大幅下降（5f），而在芳环上引入额外给电子基团，可在一定程度上补偿这一活性损失（5g）。同时，烯醛底物1的α位空间位阻显著影响反应活性与对映选择性：乙基取代底物可正常参与反应，而大位阻苄基取代底物则完全无法转化。此外，甲基乙烯基酮在该体系中同样无反应活性。
图3 底物的普适性研究
为揭示该体系高立体选择性的反应机制，研究团队开展了同位素标记与动力学同位素效应实验。首先进行了同位素标记实验（图4）：在标准反应条件下，以氘代吲哚D-4a为底物时，产物氘掺入率低于5%（图4a，反应式1）；而以非氘代底物4a在重水体系中反应时，产物氘掺入率可达64%（图4a，反应式2）。该结果明确证实，反应的α位质子来源于反应体系中的水相溶剂，而非底物分子本身。同时，实验测得底物1a与2a、1a与4a反应的动力学同位素效应（KIE）值分别为2.03和1.33（图4b、图S4及表S14），说明质子转移在上述反应的动力学过程中起到关键作用。
图4 机理研究
随后，研究人员针对进化后的突变体蛋白开展了分子动力学（MD）模拟。模拟结果表明，该人工全酶在催化过程中存在“互变”的两种主要构象状态。闭合构象下，AnAD的腺苷二磷酸核糖主链占据经典NAD⁺结合口袋，烯胺单元嵌于催化口袋并紧邻T191Q、L92I、F198残基。该构象形成密闭疏水空腔，既阻碍水分子进入以抑制质子化，又能预组织底物1a与4a至优势构型促进傅克烷基化；空腔的大位阻也解释了烯醛底物对大取代基的低兼容性（图5、图S6）。开放构象中，AnAD主链仍固定于NAD⁺结合区，柔性环外摆带动烯胺小幅旋转，使其Re面暴露于溶剂。水分子由此对Re面发生选择性质子化，生成观测到的S构型产物。模拟结果证实了动态催化机制：柔性环的构象变化同时调控催化效率与立体选择性，其中开放构象主导对映选择性质子化过程。
该研究团队开发了一种NAD⁺型辅因子AnAD，可将多种NAD(P)⁺结合蛋白重编程为亚胺离子生物催化剂，实现串联傅克烷基化-对映选择性质子化反应。通过系统筛选蛋白骨架，获得了多个立体化学结果可调的功能骨架；后续蛋白工程改造显著提升了催化效率与对映选择性，并拓展了底物范围，可兼容多种富电子芳烃及吲哚类衍生物。机理研究表明，反应活性与立体控制源于AnAD与蛋白微环境的协同作用，其中柔性环的动态运动主导了对映选择性质子化步骤。该工作进一步证实，合成NAD⁺型辅因子是一类稳健且通用的工具，可拓展广泛存在的NAD(P)⁺结合蛋白的催化功能，从而实现新的非天然生物转化。
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