小非编码RNA（sncRNA）在肿瘤发生发展中具有重要作用，并因其在体液中具有较好的稳定性，被认为是液体活检和肿瘤早期诊断的重要分子标志物。然而，单一sncRNA标志物往往难以满足复杂疾病诊断需求，多标志物联合检测被认为是提升诊断准确性的关键路径。目前sncRNA的多重检测主要依赖基于荧光的qRT‑PCR和数字PCR。尽管这些技术灵敏可靠，但它们依赖不同荧光染料的光谱区分靶标，光谱重叠效应限制了单次反应中可同时检测的靶标数量，难以满足多标志物联合分析的需求。测序方法虽具有高通量优势，但流程复杂、成本较高，限制了其在常规临床检测中的应用。
不同于荧光检测，纳米孔通过实时监测单个分子穿过纳米孔时产生的电流变化来实现分析，可从原理上避免了光谱重叠问题。然而，传统纳米孔方法对短链sncRNA的分辨能力有限，而现有的纳米孔测序或探针杂交方案又各自存在操作复杂、信号依赖外源设计等不足。为此，南京大学王玉琴课题组提出一种“扩增编码”的纳米孔传感新策略，将扩增从单纯的灵敏度增强步骤，重新定义为信息编码步骤。他们整合了茎环RT‑PCR与纳米孔传感，使每个目标sncRNA在逆转录‑扩增过程中被直接转化为结构化的茎环扩增子，并在扩增子的单链悬臂中保留目标sncRNA的天然序列窗口。当该扩增子穿过纳米孔时，一个由五个核苷酸组成的紧凑窗口直接决定了电流信号的波形，相当于在合成过程中将分子身份写入产物。这种“扩增即编码”的设计不仅避开了荧光串扰，也不需要外源条形码或复杂的测序解码。研究显示，该方法能够实现对高度同源Let-7家族成员的单核苷酸水平分辨。
图1. “扩增即编码”的纳米孔检测策略及Let-7家族单碱基区分。（a）目标sncRNA经茎环反转录和线性PCR转化为带有5′-悬臂茎环结构的编码产物，并通过MspA纳米孔进行单分子电信号读取。（b）Let-7家族成员茎环扩增子的序列编码区域及其纳米孔事件的S.D.-ΔI/Io分布图。
研究团队进一步展示了该方法的多重检测能力。他们选取八种胃癌相关sncRNA作为检测对象，包括四种miRNA（Let-7a、miR-21、miR-10b、miR-18a）和四种tRNA衍生小RNA（tRF-5026a、tRF-5015b、tRF-3019a、tRF-5027b）。结果表明，不同sncRNA的茎环扩增子产生了清晰可分的纳米孔电流指纹。结合机器学习，研究团队实现了八种sncRNA的自动分类识别，多层感知机模型在测试集中取得了超过97%的分类准确率，并进一步实现了人血清样本中胃癌相关miRNA和tsRNA的同步检测。
图2. 胃癌相关sncRNA的多重纳米孔识别。（a）本研究选取的胃癌相关sncRNA标志物，包括四种miRNA和四种tRNA衍生小RNA（tsRNA）。（b）八种sncRNA茎环扩增子混合样本的同步纳米孔检测电流轨迹，不同颜色标示由MLP机器学习分类器识别出的特征事件。（c）混合样本中各sncRNA茎环扩增子纳米孔事件的S.D.-ΔI/Io分布图。
该工作首次将“扩增”与“编码”在分子层面统一，实现非编码RNA跨类别、多靶标同步检测，为非编码RNA的高通量、低成本床旁检测开辟了新路径，也为其他核酸标志物的多重分析提供了通用设计思路。该工作发表于期刊Analytical Chemistry。论文第一作者为南京大学博士研究生刘梦宇，通讯作者为南京大学前沿科学学院王玉琴助理教授。研究得到国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费、生命分析化学全国重点实验室以及广东省污水信息解析与预警重点实验室等项目支持。
原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：
Molecular Encoding during Amplification Enables Multiplex Nanopore Profiling of Small Noncoding RNAs
Mengyu Liu, Haotian Zhang, Sha Guo, Xiaoyu Du, Xiao Xiao, Yuqin Wang*
Anal. Chem., 2026, DOI: 10.1021/acs.analchem.6c01314
导师介绍
王玉琴
https://www.x-mol.com/university/faculty/415203
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