南京农大甘薯岗位专家团队一区TOP期刊重金属成果:甘薯新基因IbHIPP7通过降低镉吸收和减少镉积累提升甘薯对镉胁迫的耐受性

同领域NMT精选文献：重金属研究

期刊：Horticulture Research

主题：重金属相关异戊二烯化植物蛋白（Hipp）基因IbHIPP7的过表达可减少甘薯镉积累并缓解镉毒性

标题：Overexpression of the Heavy metal-associated Isoprenylated Plant Protein (HIPP) gene IbHIPP7 reduces cadmium accumulation and alleviates cadmium toxicity in sweetpotato

发表年份：2025年

影响因子：8.5

单位及作者：南京农业大学 董鹏程、Yumeng Yin、Shiyuan Zhang、Yujun Fan、Xinzhe Zhang、Meng Zhang、夏妍、Chen Chen、史良、陈亚华✉

中文摘要

过表达重金属相关异戊二烯化植物蛋白（HIPP）基因IbHIPP7可降低甘薯对镉的积累并减轻镉毒性。农田土壤中的镉（Cd）污染对作物安全和人类健康构成潜在威胁。重金属相关异戊二烯化植物蛋白（HIPPs）是维管植物中一类独特的蛋白，在非生物和生物胁迫响应中起着关键作用。然而，其功能特性研究仍然有限。在本研究中，作者鉴定了一个新的甘薯HIPP基因IbHIPP7，并研究了其在镉转运和耐受中的作用。亚细胞定位显示IbHIPP7定位于质膜。功能域分析表明，两个保守的重金属相关（HMA）结构域对于镉耐受至关重要，而C末端的异戊二烯化基序则不是必需的。与野生型（WT）相比，过表达IbHIPP7的转基因甘薯品种'苏薯33'表现出显著增强的镉耐受性，并且根和地上部的镉积累量减少。这些结果表明，IbHIPP7通过减少镉吸收从而增强镉耐受性来降低镉毒性，为培育低镉积累甘薯品种以提高农业安全提供了分子基础。

根系Cd2+实时转运速率测样服务

利用基于旭月非损伤微测技术（NMT）的旭月重金属阻控机制分析仪，检测OE品系和野生型（WT）植物在5 μM CdCl₂暴露下根表面的Cd²⁺转运速率。结果表明，Cd²⁺吸收在距根冠约300 μm处最为迅速，野生型植物的吸收速率显著高于OE品系。这些结果共同表明，IbHIPP7的过表达通过减少Cd积累增强了植物对Cd的耐受性。

图1根系Cd²⁺转运速率。流速值的正负号仅代表离子转运方向，正值表示从根内排出到根外，负值表示从根外流入到根内

为进一步验证IbHIPP7过表达是否直接抑制根部镉吸收，作者利用基于非损伤微测技术（NMT）的旭月重金属阻控机制分析仪甘薯根表面的Cd²⁺转运速率。结果显示，与野生型（WT）相比，IbHIPP7过表达品系根表面的Cd²⁺流入速率显著降低。

图2根系Cd²⁺转运速率。流速值的正负号仅代表离子转运方向，正值表示从根内排出到根外，负值表示从根外流入到根内

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与NMT数据相关性较高的其他实验结果

1、IbHIPP7过表达增强拟南芥对镉的耐受性

在无镉琼脂平板上培养时，野生型（WT）植株与IbHIPP7-OE转基因株系的主根生长未见显著差异。随着镉浓度升高，根系生长逐渐受到抑制，表型差异逐渐显现：转基因株系表现出显著高于野生型的镉耐受性。为探究耐受性增强的机制，作者检测了野生型与转基因植株的镉积累量。结果显示，IbHIPP7-OE株系的地上部和根系镉浓度均显著低于野生型植株，这表明，IbHIPP7的过表达通过减少Cd积累增强了植物对Cd的耐受性。

图3过表达IbHIPP7的拟南芥对镉胁迫的表型与生理响应

其他实验结果

1、lbHIPP7的亚细胞定位

如图所示，空载体35S: GFP在细胞质和核质中呈现弥散分布，而35S: GFP :IbHIPP7的 GFP荧光信号与质膜荧光标记信号重叠，为进一步验证IbHIPP7的亚细胞定位，研究人员在两种实验体系的细胞膜上均检测到绿色荧光信号：转基因甘薯原生质体和叶表皮细胞，这两种细胞均稳定表达GFP:IbHIPP7融合蛋白，表明IbHIPP7定位于细胞膜。

图4 烟草叶片中IbHIPP7的亚细胞定位

2、异源表达IbHIPP7可赋予酵母菌镉耐受性

在含100 μM CdCl₂的SD-Ura平板上，表达IbHIPP7的酵母菌株表现出显著高于空载体（EV）对照的镉耐受性。拟南芥HIPP26在酵母中表现出较弱的耐受促进效应。在不同CdCl₂浓度的液体SD-Ura培养基中生长曲线与平板结果一致。50 μM 镉抑制生长，但表达IbHIPP7的酵母菌株与EV之间无差异。最显著的差异出现在100 μM 镉浓度时，而更高浓度的镉会增强生长抑制，从而缩小差异。综上，这些结果表明异源表达IbHIPP7可增强酵母细胞的镉耐受性。

细胞内镉浓度测定显示，表达IbHIPP7或IbHIPP26的酵母菌积累的镉量显著低于EV对照组，其中IbHIPP7使镉减少40%。这表明IbHIPP7通过降低细胞内镉水平发挥金属伴侣作用，从而增强镉耐受性。

图5 酵母中IbHIPPs的镉解毒活性测定

3、IbHIPP7的关键功能域

为阐明IbHIPP7活性的关键功能域，作者对原始酵母表达载体YES2-IbHIPP7进行了改造。具体而言，分别敲除了两个HMA结构域（MHCEAC）和C端异戊二烯基序（CTLM）的金属离子结合位点。随后将这些改造后的载体与原始载体共同转化至酵母菌株Y252中。

平板耐药性实验表明，异戊二烯基序的缺失对IbHIPP7的镉耐受功能无显著影响。相比之下，缺失任一HMA结构域的酵母细胞完全丧失了镉抗性。酵母生长曲线实验进一步验证了这些发现。在100 μM镉胁迫下，表达缺失异戊二烯基序的IbHIPP7的酵母在生长平台期的600 nm光密度（OD600）与表达完整IbHIPP7蛋白的酵母相当。相反，转化EV的酵母及表达缺失任一HMA 结构域的IbHIPP7的酵母表现出相似的镉敏感性。为评估结构域缺失如何影响酵母中镉的积累，作者定量了细胞内镉含量。结果与平板耐药性实验一致：完整IbHIPP7和异戊二烯基序缺失的酵母比EV积累的镉更少。相反，缺失任一HMA结构域的酵母与EV相比在镉积累上无显著差异。综上，这些结果证实两个HMA结构域对IbHIPP7的镉耐受功能至关重要。

图6 IbHIPP7功能域缺失对酵母耐镉性的影响

4、IbHIPP7在转基因甘薯全株水平的功能验证

qPCR实验进一步显示，OE品系中IbHIPP7的表达水平比野生型Sushu33高100-200倍；这两个OE品系被选作后续表型验证的样本。体外叶片实验显示，野生型Sushu33与转基因甘薯叶片在不含镉的MS培养基中培养一周后，未表现出显著的表型差异。然而，当使用300 μM CdCl₂处理时，野生型叶片几乎完全黄化，而IbHIPP7-OE品系仍保持绿色。这表明IbHIPP7过表达增强了甘薯叶片对镉的耐受性。由于镉胁迫会诱导ROS积累，作者对离体叶片进行了3,3‘-二氨基联苯胺（DAB）和硝基蓝四唑（NBT）染色，以验证IbHIPP7过表达是否减轻镉诱导的ROS损伤。染色结果显示，IbHIPP7-OE甘薯叶片积累的ROS显著少于野生型Sushu33，证实了IbHIPP7对镉毒性的保护作用。

图7 Sushu33转基因叶片在0和300 μM 氯化镉处理后的表型

5、IbHIPP7过表达增强甘薯对镉的耐受性

为阐明IbHIPP7过表达在甘薯镉积累中的作用，本研究采用镉污染土壤进行了盆栽实验。结果显示，在对照土壤（非镉污染土壤）中，野生型与转基因甘薯的根、茎、叶及叶柄生物量无显著差异。然而，当在镉污染土壤中栽培时，IbHIPP7过表达甘薯的根、茎、叶及叶柄生物量均显著高于野生型。这一发现表明，IbHIPP7过表达可增强甘薯对镉的耐受性。

对不同甘薯器官中镉（Cd）浓度的检测表明，与野生型（WT）相比，转基因甘薯的根、茎和叶中镉浓度分别降低了28%、42%和38%。值得注意的是，两组间叶柄镉浓度未观察到显著差异。这一观察结果表明，IbHIPP7可能通过调节叶柄的生理功能，来调控甘薯地上部分镉的转运与再分配。

图8 Cd污染土壤中甘薯的盆栽试验

结论

本研究从甘薯中鉴定并功能表征了一个重金属相关异戊烯化植物蛋白基因IbHIPP7。该基因编码含两个HMA结构域和一个C端异戊烯化基序的蛋白，定位于细胞质膜。异源表达实验表明，IbHIPP7可显著增强酵母对镉的耐受性，并降低酵母细胞内镉积累量；而缺失任一HMA结构域均使其功能丧失，证实两个HMA结构域对镉解毒不可或缺。在拟南芥中过表达IbHIPP7同样提高了转基因植株对镉的耐受性，并减少了根系对镉的吸收。进一步在甘薯（品种‘苏薯33’）中过表达IbHIPP7，转基因植株在镉污染土壤中生长明显优于野生型，根系、茎和叶片中的镉浓度分别降低28%、42%和38%，但叶柄中镉浓度无显著变化，而叶柄镉占比升高，提示IbHIPP7可能通过调节叶柄维管组织中的镉再分配来参与整体镉平衡。综上所述，IbHIPP7是一个通过减少根系镉吸收和调控地上部镉分配来增强甘薯镉耐受性的关键基因，为低镉积累甘薯的分子育种提供了重要靶点。

检测离子/分子指标（NMT实验）

Cd²⁺

检测样品及具体位点（NMT实验）

拟南芥根、甘薯根分生区，即距离根尖300 μm处的根表上的点

测试液

0.1 mM KCl、0.01 mM CdCl₂、0.3 mM MES、 pH 5.6

仪器信息

旭月耐盐机制分析仪

旭月植物养分高效机制分析仪

旭月重金属阻控机制分析仪

旭月Physiolyzer®（NMT活体生理检测仪®）

供稿人简介

姜程浩，沈阳农业大学园艺学院博士，主要从事光信号调控离子吸收的研究。