【JMC】南京医科大学/江苏省原子医学研究所林建国/邱玲:一种新型PD-L1小分子免疫诊疗一体化探针用于精准肿瘤免疫治疗

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近日，南京医科大学/江苏省原子医学研究所林建国/邱玲团队在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry上发表了一篇题为"PD-L1靶向小分子免疫诊疗一体化药物的研制及其在个体化抗肿瘤免疫治疗中的应用"的研究论文。该研究开发了一种新型小分子免疫诊疗一体化探针 [¹⁸F]LG-8 及其对应的治疗化合物 LG-8，两者具有完全相同的化学结构，确保了诊断与治疗功能的一致性。研究证实，[¹⁸F]LG-8 PET显像能够特异性定量检测小鼠黑色素瘤（B16-F10）和肺癌（LLC）模型中的PD-L1表达水平，而LG-8在PD-L1高表达的B16-F10肿瘤中表现出显著的抗肿瘤疗效，在PD-L1低表达的LLC模型中则无治疗效果，验证了诊断显像对疗效的预测价值。此外，研究团队创新性地实施了基于[¹⁸F]LG-8 PET显像指导的个体化化学-免疫联合治疗策略：通过顺铂预处理上调部分LLC肿瘤的PD-L1表达，仅在PD-L1水平升高的小鼠中给予LG-8治疗，从而实现了精准的患者分层治疗。该诊疗一体化策略将精确诊断与免疫治疗整合于统一的分子平台，显著提高了治疗响应预测能力，为推进肿瘤精准免疫治疗提供了新思路。

研究背景

免疫检查点阻断（ICB）疗法，特别是靶向PD-1/PD-L1通路的治疗，已显著改变了癌症治疗格局，但临床批准的PD-1/PD-L1单克隆抗体面临诸多挑战：免疫相关不良事件（irAEs）发生率高、客观响应率有限（仅20-30%患者获益）、原发性和获得性耐药、组织渗透性差、药代动力学不灵活及生产成本高昂等。小分子PD-L1抑制剂具有口服生物利用度、优异组织渗透性、可控药代动力学及较低生产成本等潜在优势，但现有联苯类小分子化合物存在水溶性差、药代动力学特性不佳等问题，阻碍其临床转化。此外，当前PD-L1抗体治疗缺乏可靠的伴随诊断工具进行患者分层，免疫组化（IHC）检测PD-L1表达存在肿瘤异质性和判读不一致等问题，预测准确性不足。分子影像技术，特别是正电子发射断层扫描（PET），可无创定量评估全身病灶的PD-L1表达，是指导个体化免疫治疗的强有力诊断工具。诊疗一体化（Theranostics）将诊断与治疗整合于单一分子，可实现药物分布和靶点结合的可视化、指导患者筛选、监测治疗反应，为克服当前免疫治疗挑战提供了创新思路。

重点内容

1. 小分子免疫诊疗一体化探针的设计与构建：研究团队基于前期报道的苯氧甲基联苯骨架，在氰基位置引入不同功能基团（羧基、氟磺酰基、氨基、硝基、羟基），设计合成了五种新型化合物LG-4至LG-8及其对应的¹⁸F标记探针[¹⁸F]LG-4至[¹⁸F]LG-8。通过铜催化的叠氮-炔基环加成反应实现放射标记，放射化学产率为13-21%，摩尔活度为30-38 GBq/μmol，放射化学纯度均>98%。体外稳定性实验显示，所有探针在PBS和血清中37°C孵育2小时后完整性>98%。

2. 体外细胞摄取与体内PET显像评价：细胞摄取实验显示，[¹⁸F]LG-8在B16-F10细胞中的摄取最高（2小时达15.02±1.11%），且可被非放射性LG-8显著阻断，证实其特异性结合。小动物PET显像显示，[¹⁸F]LG-8在B16-F10肿瘤中的摄取最高（5.11±0.07%ID/mL），且正常组织信号明显降低。与前期报道的[¹⁸F]LG-3相比，[¹⁸F]LG-8具有相当的肿瘤摄取（3.29-3.57%ID/mL vs 3.11-3.44%ID/mL），但肝脏（1.59 vs 1.74%ID/mL）和肠道摄取（小肠0.22 vs 2.08%ID/mL）显著降低，背景信号改善明显。

3. 免疫诊疗一体化效应验证：[¹⁸F]LG-8在PD-L1高表达的B16-F10肿瘤中摄取显著（5.32±0.07%ID/mL），而在PD-L1低表达的LLC肿瘤中摄取较低（1.67±0.16%ID/mL）。治疗实验显示，LG-8（2 mg/kg）对B16-F10肿瘤具有显著抑制作用（肿瘤体积从1888±253 mm³降至110±76 mm³），肿瘤PD-L1表达降低，CD8⁺T细胞浸润增加；而对LLC肿瘤无显著疗效。结果表明，[¹⁸F]LG-8的肿瘤摄取与LG-8的治疗效果高度相关，验证了"诊疗一体化"策略的可行性。

4. 基于PET显像指导的个体化化学-免疫联合治疗：针对LLC肿瘤PD-L1低表达导致LG-8疗效不佳的问题，研究团队设计了顺铂（CDDP）预处理的个体化治疗策略：LLC荷瘤小鼠先接受顺铂（2 mg/kg，隔日一次，共3次）治疗，通过[¹⁸F]LG-8 PET显像（第1天和第7天）监测PD-L1表达变化。结果显示，13只治疗小鼠中5只出现PD-L1上调（ROI≥5%ID/mL），8只无显著变化（ROI<5%ID/mL）。后续LG-8治疗仅对PD-L1上调组（PD-L1+）产生显著抗肿瘤效果（肿瘤体积1129±453 mm³ vs 对照组1938±269 mm³），而单纯顺铂组（CDDP）和PD-L1未上调组（PD-L1-）无显著疗效。该策略成功克服了治疗响应异质性，避免了无响应患者的不必要毒性。

研究总结

本研究开发了一种基于小分子PD-L1靶向的免疫诊疗一体化新策略，通过构建结构完全一致的诊断探针[¹⁸F]LG-8和治疗化合物LG-8，实现了"所见即所治"的精准医疗理念。研究证实[¹⁸F]LG-8 PET显像可无创、定量、特异性地检测肿瘤PD-L1表达，有效区分不同PD-L1水平的肿瘤，且其摄取水平与LG-8的治疗效果密切相关，为筛选潜在获益患者提供了可靠工具。更重要的是，研究团队创新性地将[¹⁸F]LG-8 PET显像与化学-免疫联合治疗相结合，通过监测顺铂诱导的PD-L1上调，实现了基于个体生物学特征的精准分层治疗，显著提高了治疗响应率并避免了无效治疗。该研究通过统一化学结构整合诊断与治疗功能，克服了传统诊疗分离策略中药代动力学不一致的关键缺陷，为肿瘤精准免疫治疗提供了新的技术范式，具有广阔的临床转化前景。

图片来源：ACS

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①化学与放射化学合成

研究团队在前期工作中已报道了多种基于苯氧甲基联苯骨架的PD-L1小分子PET显像探针，其中最近报道的[¹⁸F]LG-3探针具有三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）端基和PEG链，能够精确监测PD-L1表达水平及其动态变化，但该探针在腹部的信号相对较高，促使团队继续优化其结构。研究表明，氰基位置的取代基显著影响探针与PD-L1的亲和力，因此团队进一步引入其他功能基团，一方面增强探针的肿瘤摄取，另一方面减少其在正常组织的蓄积，从而提高肿瘤特异性。综合考虑不同极性和电性，选择了羧基、氟磺酰基、氨基、硝基和羟基。非放射性化合物LG-4至LG-8的详细合成步骤见补充材料方案S1，HPLC分析显示其纯度均大于95%。所有新化合物均经¹H/¹³C NMR或ESI-MS表征。放射性标记[¹⁸F]LG-4至[¹⁸F]LG-8通过前体化合物4R与¹⁸F标记基团[¹⁸F]P1经铜催化的叠氮-炔基1,3-偶极环加成反应完成，根据前期报道的方法，总衰变校正放射化学产率为13±4%至21±6%，摩尔活度为30±3至38±9 GBq/μmol，经半制备HPLC纯化后所有探针的放射化学纯度均大于98%。[¹⁸F]LG-4至[¹⁸F]LG-8的稳定性在PBS和血清中进行了测试，所有探针在37°C孵育2小时后完整性均大于98%，显示出优异的体外稳定性。对于LG-8，团队进一步检测了其48小时体外稳定性和2小时体内稳定性，结果显示其在两种体系中均具有良好的稳定性。

②细胞摄取与体内PET显像

为评估[¹⁸F]LG-4至[¹⁸F]LG-8与PD-L1的结合，首先在鼠黑色素瘤细胞系B16-F10中进行细胞摄取实验。结果显示，所有探针在0.5小时均快速摄取并在2小时后维持高水平，其中[¹⁸F]LG-4摄取最低（2小时为2.13±0.22%），[¹⁸F]LG-5、[¹⁸F]LG-6和[¹⁸F]LG-7摄取相近（分别为4.19±0.06%、5.11±0.29%和4.96±0.19%），而[¹⁸F]LG-8摄取最高（15.02±1.11%）。值得注意的是，加入相应非放射性化合物后，这些探针的结合均可被显著阻断，2小时摄取分别降至0.24±0.08%、0.55±0.11%、1.53±0.02%、1.21±0.12%和1.21±0.03%，表明探针与肿瘤细胞特异性结合。随后，通过B16-F10荷瘤小鼠PET显像在注射后2小时进一步评估探针的体内结合。[¹⁸F]LG-4肿瘤摄取最低（0.52±0.05%ID/mL）且腹部活性高；[¹⁸F]LG-5至[¹⁸F]LG-7具有相似的体内特征，肿瘤摄取中等（分别为4.23±0.04%、3.58±0.06%和3.53±0.05%ID/mL）；而[¹⁸F]LG-8肿瘤摄取最高（5.11±0.07%ID/mL），且正常组织和器官信号强度明显降低，与前期报道的[¹⁸F]LG-3相当。这些结果与体外细胞摄取结果一致，表明不同取代基不仅改变了[¹⁸F]LG-4至[¹⁸F]LG-8的体内分布，也影响了其与PD-L1的结合。分子对接研究进一步确定了LG-8与PD-L1蛋白的相互作用位点：酚羟基与Leu-74和Asp-73氨基酸残基形成氢键，Tris部分的羟基与Tyr-56、Gln-66、Lys-124和Asp-122相互作用，PEG链与Arg-125残基有额外相互作用，表明LG-8的极性尾链有助于与PD-L1蛋白形成氢键以增强结合亲和力。

①[¹⁸F]LG-8/LG-8的免疫诊疗一体化效应

为探究[¹⁸F]LG-8/LG-8的免疫诊疗一体化效应，研究团队首先评估了[¹⁸F]LG-8在不同肿瘤模型中的PET显像性能。结果显示，[¹⁸F]LG-8在B16-F10肿瘤中的摄取显著高于LLC肿瘤（2小时分别为5.32±0.07%ID/mL和1.67±0.16%ID/mL），这主要归因于两种肿瘤PD-L1表达水平的差异，并经免疫组化染色证实。为进一步验证[¹⁸F]LG-8对PD-L1的特异性，在B16-F10荷瘤小鼠中进行了LG-8阻断PET显像，结果显示2 mg LG-8阻断1小时后肿瘤摄取从5.45±0.16显著降至3.43±0.23%ID/mL，表明其与PD-L1特异性结合。随后，研究团队在两种肿瘤模型中考察了LG-8的免疫治疗效果。在B16-F10模型中，LG-8显著抑制肿瘤生长，7个治疗周期后对照组和治疗组的平均肿瘤体积分别为1888±253 mm³和110±76 mm³，肿瘤PD-L1表达明显降低而CD8⁺T细胞浸润显著增加，放射自显影和免疫荧光实验也证实了治疗前后肿瘤PD-L1表达的变化。相比之下，LG-8对LLC肿瘤几乎无治疗效果，治疗前后肿瘤体积无显著变化（2044±136 mm³ vs 2033±248 mm³）。两组小鼠体重均略有增加，LLC治疗组体重虽略低于对照组但无统计学差异。上述结果表明，[¹⁸F]LG-8肿瘤摄取越高，LG-8治疗效果越好，即[¹⁸F]LG-8可精准识别将从LG-8小分子抑制剂治疗中获益的患者，实现[¹⁸F]LG-8/LG-8指导的免疫诊疗一体化策略。尽管类似概念已有研究提出，但核心创新在于这一统一结构确保了诊断和治疗功能的药代动力学和生物分布完全一致，克服了分别给予诊断和治疗药物时因分子大小、电荷、结合亲和力和药代动力学差异导致生物分布不一致和治疗响应预测不可靠的关键缺陷。

②基于[¹⁸F]LG-8/LG-8的个体化化学免疫治疗

化学免疫治疗目前是多类恶性肿瘤的一线治疗方案，但其广泛应用仍面临若干关键障碍：首先，治疗疗效高度异质，部分患者获得持久缓解而另一些患者获益甚微或无获益，且缺乏可靠的预测性生物标志物来识别最佳人群；其次，毒性重叠风险显著，化疗药物可导致骨髓抑制和胃肠道毒性，免疫检查点抑制剂可能触发免疫相关不良事件，迫使治疗中断或终止。这些挑战日益表明"一刀切"策略不足，促使向个体化治疗转变以优化化学免疫联合治疗。前期研究反复证实顺铂可上调肿瘤PD-L1表达，基于此，研究团队假设LG-8与顺铂联合可能克服PD-L1低表达肿瘤的疗效局限。为验证该假设，团队进一步探索了[¹⁸F]LG-8指导的LG-8联合顺铂个体化治疗在LLC肿瘤中的应用。LLC荷瘤小鼠随机分为对照组（n=4）和治疗组（n=13），治疗组先接受顺铂（2 mg/kg，隔日一次，共3次）给药，所有小鼠在生理盐水或顺铂给药前（第1天）和后（第7天）均行[¹⁸F]LG-8 PET显像。根据PET显像的肿瘤感兴趣区（ROI），治疗组小鼠进一步分为三个亚组：顺铂亚组（CDDP，不论PD-L1表达，n=4）、PD-L1低表达亚组（PD-L1-，ROI<5%ID/mL，n=5）和PD-L1高表达亚组（PD-L1+，ROI≥5%ID/mL，n=4）。随后，CDDP亚组仅接受生理盐水治疗，而低表达亚组和高表达亚组接受LG-8（2 mg/kg）治疗。结果显示，对照组小鼠第1天和第7天的[¹⁸F]LG-8肿瘤摄取无显著变化（1.62±0.11%ID/mL vs 2.04±0.19%ID/mL），而治疗组小鼠经顺铂治疗后[¹⁸F]LG-8肿瘤摄取呈现个体差异：13只治疗小鼠中5只显示[¹⁸F]LG-8肿瘤摄取显著增加（ROI≥5%ID/mL），其余8只肿瘤摄取低于5%ID/mL。后续LG-8治疗效果显示，CDDP亚组（1815±206 mm³）和PD-L1-亚组（1658±163 mm³）的肿瘤体积与对照组（1938±269 mm³）相比略有减小但无显著差异，CDDP与PD-L1-亚组相当的肿瘤体积表明LG-8对PD-L1-亚组小鼠无治疗效果；相反，PD-L1+亚组的肿瘤生长显著延缓至1129±453 mm³，表明LG-8的免疫治疗效果与[¹⁸F]LG-8的肿瘤摄取密切相关。此外，各组小鼠均未观察到显著体重下降。所有结果表明，利用[¹⁸F]LG-8 PET显像可根据个体差异准确指导基于小分子抑制剂LG-8的化学免疫联合治疗。

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https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c03238