南京农大棉花遗传与种质创新利用团队揭示逆转座子插入GhNAC140-Dt启动子促进棉花产量提高新机制

1. GhNAC140-Dt基因启动子区LTR转座子插入与棉花高衣分性状显著关联

2. LTR序列特异性招募转录因子GhMYB46大幅提升GhNAC140-Dt基因表达

为验证转座子插入对基因表达的直接影响，研究者克隆了GhNAC140-Dt的两种启动子片段：包含全长5108bp转座子的6977bp片段以及不包含转座子的1634 bp片段，同时克隆了GhNAC140-At的1869 bp启动子片段。通过棉纤维瞬时转化系统进行GUS报告基因检测发现，由P6977驱动的GUS表达强度显著高于P1634和P1869，而后两者活性无显著差异，证明了该逆转座子插入具有增强下游基因表达的活性。对该转座子的结构分析显示，其两端各有一个459bp的长末端重复序列（LTR1和LTR2），两者序列高度同源。功能实验表明，单独的LTR2序列足以产生与全长转座子相当的转录增强活性。为进一步精确定位功能区域，将LTR2截短为4个重叠的150bp片段，发现仅LTR2-2片段能强效激活报告基因表达。表明LTR2内部一个150bp的区域（LTR2-2）是负责转录激活功能的关键增强子。为阐明LTR2-2片段增强转录的机制，研究进一步鉴定了与之结合的反式作用因子。通过双荧光素酶报告系统筛选与次生细胞壁发育相关的候选转录因子，发现GhMYB46等6个转录因子能显著激活由LTR2-2驱动的报告基因，而GhMYB52-Like则起抑制作用（图2a）。研究发现，当使用不含LTR的原始GhNAC140-Dt启动子（P1634）进行相同实验时，GhMYB46失去了激活能力，而其他5个激活因子仍能结合并激活（图2b）。这证明GhMYB46是被LTR2-2特异性招募的转录因子，其结合依赖于转座子序列的引入。进一步的GUS活性比较实验证实，GhMYB46对“LTR+天然启动子”复合体的转录驱动作用最为关键（图2c）。将150bp的LTR2-2截短为三个重叠的60bp片段，发现GhMYB46特异性地结合其中的LTR2-2-1片段（图2d）。酵母单杂交和电泳迁移率实验均验证了GhMYB46与LTR2-2-1片段的直接、特异性结合（图2e、2f）。研究揭示了一个清晰的分子通路：LTR转座子插入带来的一个60bp核心顺式调控模块，通过特异性招募转录激活因子GhMYB46，显著提升了下游GhNAC140-Dt基因的表达。

3. 过表达GhNAC140-Dt提高棉花纤维衣分产量

GhNAC140-Dt定位于细胞核（图3a）。为探究GhNAC140-Dt的功能，研究创建了该基因的过表达和RNA干扰转基因棉花株系（图3b）。田间表型鉴定表明，与野生型相比，GhNAC140-Dt过表达株系的衣分和衣指显著增加，而RNAi株系则降低（图3c、3d）。在细胞学水平上，透射电镜显示过表达株系在开花后20天及成熟纤维的次生细胞壁厚度显著增加，纤维素含量也相应升高；RNAi株系则呈现相反表型（图3e-h）。这证实了GhNAC140-Dt通过促进纤维素沉积和细胞壁增厚显著提升衣分产量。

4. GhNAC140-Dt直接调控GhCESA4-At/Dt和GhCOBL9-At表达促进细胞壁组分合成

通过整合过表达和RNAi株系的转录组数据分析以及GhNAC140-Dt蛋白的DNA亲和纯化测序（DAP-seq），研究揭示了该转录因子的直接下游靶基因。多组学数据交叉鉴定出三个共同靶点：编码纤维素合酶的GhCESA4-Dt和GhCESA4-At，以及编码COBRA-like蛋白的GhCOBL9-At。这些基因在过表达株系中上调，在RNAi株系中下调（图4a，4b）。双荧光素酶报告实验、电泳迁移率实验和酵母单杂交实验均证实，GhNAC140-Dt能直接结合这些靶基因的启动子并激活其转录（图4c-g）。表明GhNAC140-Dt能够直接与GhCESA4-Dt、GhCESA44-At和GhCOBL9-At的启动子结合，从而调控这些基因的表达。

5. LTR转座子插入在棉花驯化改良进程中受到强烈的正向人工选择

进化分析显示，这一转座子插入事件在棉花二倍体祖先（AA和DD）、野生四倍体棉种中均不存在。它在陆地棉半野生种系中出现，并在latifolium和punctatum高频分布。这一优异等位变异在现代栽培陆地棉品种中进一步固定，其频率超过80%，表现出明显的驯化选择信号（图5a）。选择性清除分析表明，该区域在从陆地棉半野生种到地方品种，再到现代品种的过程中，经历了连续的人工选择，遗传分化指数（Fst）增高，而核苷酸多样性（π）降低。对中国不同棉花种植生态区305个陆地棉推广品种的转座子插入分析表明，这一有利单倍型（Hap1）已在各主产区的推广品种中被广泛选择和固定（图5b）。上述推广品种按照在中国审定年份分析也表明GhNAC140-DtHap1的比例在不同育种年份间均很高（图5c）。研究表明该LTR逆转座子插入事件是棉花驯化与改良过程中为实现高产育种而被强烈正向选择的分子标记，为“转座子驱动作物产量进化”提供了直接的分子证据。

References:

l Akakpo, R., Carpentier, M.C., Ie Hsing, Y. and Panaud, O. (2020) The impact of transposable elements on the structure, evolution and function of the rice genome. New Phytologist226: 44-49.

l Alseekh, S., Scossa, F. and Fernie, A.R. (2020) Mobile transposable elements shape plant genome diversity. Trends in Plant Science25: 1062-1064.

l Butelli, E., Licciardello, C., Zhang, Y., et al. (2012) Retrotransposons control fruit-specific, cold-dependent accumulation of anthocyanins in blood oranges. Plant Cell24: 1242-1255.

l Feschotte, C. (2008) Transposable elements and the evolution of regulatory networks. Nature Reviews Genetics9: 397-405.

l Hayashi, K. and Yoshida, H. (2009) Refunctionalization of the ancient rice blast disease resistance gene Pit by the recruitment of a retrotransposon as a promoter. Plant Journal57: 413-425.

l Orgel, L.E. and Crick, F.H.C. (1980) Selfish DNA: the ultimate parasite. Nature284: 604-607.

l Rebollo, R., Romanish, M.T. and Mager, D.L. (2012) Transposable elements: an abundant and natural source of regulatory sequences for host genes. Annual Review of Genetics46: 21-42.

l Studer, A., Zhao, Q., Ross-Ibarra, J., et al. (2011) Identification of a functional transposon insertion in the maize domestication gene tb1. Nature Genetics43: 1160-1163.