【EJMC】南京师范大学开发新型光降解靶向嵌合体(PDTAC)用于膀胱癌精准治疗

近日，南京师范大学化学与材料科学学院周林/张继双团队在药物化学权威期刊《European Journal of Medicinal Chemistry》（EJMC）上发表了一篇题为"Light-activated targeted degradation of VHL drug for selective tumor"的研究论文。该研究首次报道了以VHL（Von Hippel-Lindau）蛋白为靶点的光降解靶向嵌合体（PDTAC）药物设计策略，成功开发了兼具高光毒性指数（PI = 36,397）和超高选择性指数（SI = 749）的PDTAC分子ZnPc-PEG₂-VH032，为克服传统PROTAC脱靶毒性及光动力治疗中肿瘤边界难以界定导致的正常组织损伤问题提供了创新性解决方案。

研究团队基于膀胱癌细胞（T24）与正常尿路上皮细胞（SV-HUC-1）中VHL对CDK2/4调控活性的差异，设计合成了三种不同连接链（无连接链、PEG₂、丁基链）的PDTAC分子。其中，ZnPc-PEG₂-VH032在光照条件下可高效降解VHL蛋白，并通过抑制CDK2/4磷酸化激活诱导G1期细胞周期阻滞，显著增强肿瘤细胞对光动力治疗（PDT）诱导氧化损伤的敏感性。该化合物在T24细胞中展现出36,397的超高光毒性指数，较临床用光敏剂Photosens®（PI = 725）提升约50倍；更重要的是，其对肿瘤细胞的选择性指数高达749，实现了无需精确控制光照范围即可选择性杀伤肿瘤细胞的目标，有效规避了传统PDT中因光照溢出导致的瘤周正常组织损伤风险。

机制研究表明，T24细胞对ZnPc-PEG₂-VH032的摄取能力显著高于SV-HUC-1细胞（约2.6倍），且VHL在T24细胞中对CDK2/4的调控更为活跃，这两个因素共同赋予了该化合物卓越的肿瘤选择性。在原位非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）小鼠模型中，膀胱灌注给药的ZnPc-PEG₂-VH032联合光照治疗展现出与临床一线化疗药物丝裂霉素C（MMC）相当的抗肿瘤效果，且具有良好的生物安全性。

该研究不仅揭示了VHL作为肿瘤精准治疗靶点的潜力，更开创了高PI与高SI兼具的PDTAC研究新方向，为开发新一代选择性抗肿瘤药物提供了重要的理论依据和结构参考。

在抗肿瘤治疗中，提高抗癌疗效同时避免对正常组织产生毒性是一项关键科学挑战，开发能够选择性杀伤肿瘤细胞的药物是解决这一问题的核心策略。蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）由靶蛋白配体、连接链和E3泛素连接酶配体组成，可诱导高表达、异常激活或对肿瘤细胞生存至关重要的靶蛋白发生泛素化和降解，目前已有数十种PROTACs进入临床试验。然而，大多数靶蛋白和E3泛素连接酶并非肿瘤细胞所特有，导致PROTACs在正常细胞中降解靶蛋白而产生脱靶毒性，例如靶向BET的PROTACs被发现在正常组织中抑制BET蛋白，引发嗜睡、皮肤状况恶化、活动能力下降和脊柱弯曲等不良反应，脱靶毒性仍是制约PROTACs临床应用的主要挑战之一。光降解靶向嵌合体（PDTACs）为解决这一挑战提供了新思路，其由靶蛋白配体、连接链和光敏剂组成。2022年，刘团队将光敏剂维替泊芬（VPF）与谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）靶向配体连接，创建了首个PDTAC，配体结合GPX4后，在病变部位光照使VPF产生活性氧（ROS）降解GPX4，通过控制光照区域可将GPX4降解限制在病变部位，理论上避免脱靶毒性。但在实际应用中，肿瘤边界难以界定，现有光照技术难以精确限制照射范围，导致光照难以严格控制在肿瘤边界内，可能在杀伤癌细胞的同时损伤肿瘤相邻的正常组织。

①光化学性质与细胞内摄取研究

构建靶向VHL的PDTACs时，研究者以光敏剂ZnPc-COOH和VHL配体VH032-NH₂为骨架，合成了无连接链、PEG连接链和丁基链三种PDTACs分子（ZnPc-VH032、ZnPc-PEG₂-VH032和ZnPc-butyl-VH032）。紫外-可见光谱显示，三者在水中均呈现VH032特征峰（270 nm）、酞菁B带及分裂的Q带（单体峰约685 nm，聚集峰约635 nm），表明以单体和聚集体形式共存；在DMSO中仅呈现674 nm处单体峰，表明主要以单体形式存在。DLS测得水合粒径约150 nm，证实其在PBS中发生聚集。荧光光谱显示三者轮廓基本一致。ROS产生能力检测表明，水中三者经680 nm光照后产率相当，仅产生O₂•⁻，主要通过I型机制；DMSO中则通过I型和II型双重途径产生总ROS、O₂•⁻、¹O₂和•OH。

②细胞内活性氧产生能力研究

PDT基于光敏剂、光和氧的协同作用，光敏剂在特定波长光照下产生ROS，损伤细胞内生物大分子导致细胞死亡。三线态光敏剂主要通过两种机制产生ROS：I型通过电子或氢原子转移产生超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基，II型通过能量转移产生单线态氧。系统比较三种药物的ROS产生能力发现，ZnPc-PEG₂-VH032和ZnPc-butyl-VH032的总ROS（DCFH-DA为探针）产生能力相似且高于ZnPc-VH032；具体而言，前两者主要通过I型和II型双重途径产生ROS，•OH产生最为显著，而ZnPc-VH032主要通过II型途径产生ROS，¹O₂（SOSG为探针）为其主要ROS种类。此外，三种光敏剂处理后细胞内O₂•⁻荧光信号均降低，这可能与细胞内超氧化物歧化酶（SOD）的高效清除机制有关，SOD将高活性O₂•⁻快速转化为相对稳定的H₂O₂；进一步荧光成像评估显示，ZnPc-VH032和ZnPc-PEG₂-VH032处理组H₂O₂荧光增强（NPS-H₂O₂为探针），而ZnPc-butyl-VH032组未检测到H₂O₂产生。溶液与细胞内ROS产生机制的差异可能源于：水溶液环境简单，PDTACs倾向于以聚集态存在，聚集态PDTACs更易通过I型机制发挥作用；而细胞内环境复杂，富含脂质、蛋白质和核酸等生物分子，PDTACs与这些分子相互作用后促进部分解聚为单体，单体可通过II型机制高效产生¹O₂，未解聚的PDTACs则通过I型机制发挥作用，同时激发态光敏剂与相邻生物底物发生电子/质子转移产生自由基。因此，溶液中PDTACs主要通过I型机制产生ROS，而细胞内则涉及I型和II型两种途径。

③体外抗肿瘤活性研究

研究者考察了三种PDTACs的抗肿瘤活性，三者均被T24细胞内化，ZnPc-PEG₂-VH032摄取量最高。暗毒性和光毒性研究显示，三者暗毒性均较低（IC₅₀ > 200 μM），含连接链的酞菁光毒性更优；ZnPc-VH032、ZnPc-PEG₂-VH032和ZnPc-butyl-VH032的PI值分别为166、36,397和21,444，ZnPc-PEG₂-VH032较另两者分别提高219倍和1.70倍。Calcein AM/PI双染显示ZnPc-PEG₂-VH032细胞毒活性最强；Annexin V-FITC/PI双染显示其诱导凋亡最显著，早期凋亡占0.83%，晚期凋亡占41.0%，表明其具有最优的T24细胞杀伤活性，值得后续深入研究。

④ZnPc-PEG₂-VH032的PDTACs活性研究

首先采用Western blot检测不同处理条件下细胞内VHL表达水平：与空白对照组相比，VH032组、光照组、ZnPc-PEG₂-VH032组、VH032+ZnPc-PEG₂-VH032组和ZnPc-PEG₂+光照组的VHL表达均无显著差异，而ZnPc-PEG₂-VH032+光照处理组VHL水平显著下调；当细胞预先用VH032-NH₂孵育以竞争ZnPc-PEG₂-VH032结合位点时，该组VHL水平上调，表明VHL是ZnPc-PEG₂-VH032介导杀伤T24细胞的靶蛋白，且其降解并非由无差别ROS介导的蛋白损伤所致，而是PDTACs结合配体后破坏VHL的结果。采用细胞热迁移实验（CETSA）研究ZnPc-PEG₂-VH032对VHL热稳定性的影响，多数CETSA研究基于配体诱导的热稳定性增强验证靶标结合，但近期文献表明金属离子和金属配合物药物也可能导致靶蛋白热稳定性降低；结果显示与ZnPc-PEG₂-VH032相互作用后VHL热稳定性下降，进一步证实其有效结合VHL。竞争性结合实验显示，VHL配体预处理显著降低ZnPc-PEG₂-VH032的光动力肿瘤杀伤活性，证明其与VHL的特异性结合对靶向光降解至关重要，而非非特异性ROS介导的蛋白损伤。采用Autodock Vina进行分子对接研究，ZnPc-PEG₂-VH032与VHL的结合能为-9 kcal/mol，表明具有高亲和力和稳定相互作用；其VHL配体VH032-NH₂与文献报道的PROTAC分子结合位点相同，配体部分与VHL的His115和Tyr112残基形成氢键，整个分子还与Val439、Pro97和Asp92等周围残基相互作用，使ZnPc-PEG₂-VH032与VHL紧密接近，确保光照产生的ROS可直接氧化损伤VHL而无需长距离扩散。

⑤ZnPc-PEG₂-VH032介导的光动力治疗协同清除T24细胞

文献报道VHL与p53结合，阻止p53形成四聚体结构，阻断p53通过p21细胞周期抑制因子介导的细胞周期阻滞，从而促进癌细胞增殖并增强肿瘤对治疗干预的抵抗性；p21是细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂，通过结合CDK2/4/6-细胞周期蛋白复合物抑制其活性，因此降解VHL可解除其对p53的抑制作用，恢复p53功能以抑制CDK2/4/6磷酸化激活，从而抑制肿瘤细胞增殖。文献及前期研究表明，细胞周期进程受抑制时抗氧化酶活性可能降低，增加氧化损伤风险。基于此，研究者假设ZnPc-PEG₂-VH032抑制CDK2/4磷酸化激活，增强细胞对ROS损伤的敏感性，从而放大PDT诱导的肿瘤杀伤效果。为验证该假设，首先考察VHL降解是否诱导细胞周期阻滞：与空白对照组相比，VH032、光照、ZnPc-PEG₂-VH032、VH032+ZnPc-PEG₂-VH032和ZnPc-PEG₂+光照组均无显著周期阻滞，而ZnPc-PEG₂-VH032+光照组G1期细胞增加；细胞预先用VH032孵育竞争结合位点后，该组G1期细胞减少，表明ZnPc-PEG₂-VH032通过PDTACs机制有效降解VHL，诱导细胞周期G1期阻滞。随后检测CDK2/4/6磷酸化水平，结果显示ZnPc-PEG₂-VH032+光照组对p-CDK6水平无显著影响，但p-CDK2和p-CDK4水平显著降低；预先用VH032竞争结合位点后，该组p-CDK2和p-CDK4水平回升。CDK2和CDK4是细胞周期关键激酶，通过磷酸化Rb蛋白促进细胞由G1期进入S期；VHL降解后抑制CDK2/4活性，从而阻止Rb蛋白磷酸化，使细胞阻滞于G1期。H₂O₂是常用氧化应激诱导剂，可模拟光敏剂产生ROS对肿瘤细胞的细胞毒性作用；500 μM和1000 μM H₂O₂存在下，CDK2/4/6抑制剂（ZnPc-SFeCO）显著增加T24细胞对氧化损伤的敏感性，表明CDK2和CDK4抑制与光动力治疗联合具有协同增敏效应。作为PDTAC药物，ZnPc-PEG₂-VH032既靶向VHL又发挥光敏剂功能，通过产生的ROS特异性降解VHL，引起细胞周期阻滞并增强细胞对PDT氧化损伤的敏感性，从而实现优越的抗肿瘤治疗效果。

⑥ZnPc-PEG₂-VH032选择性杀伤T24细胞的机制探究

临床PDT中肿瘤边界难以界定，光照可能损伤瘤周正常组织。研究考察了ZnPc-PEG₂-VH032对SV-HUC-1细胞的毒性：其暗毒性较低（IC₅₀ = 190.224 μM），但光毒性IC₅₀较T24细胞高749倍，PI值仅45，SI高达749，实现了无需控制光照范围即可选择性杀伤肿瘤细胞。与文献报道的SI值（22.1、18.6、498）相比，本研究SI达749具有显著优势。机制研究表明，T24细胞对ZnPc-PEG₂-VH032的摄取率高于SV-HUC-1细胞（荧光强度约2.6倍），且VHL表达水平虽相似，但T24细胞增殖更快、CDK2/4激活水平更高，VHL对其调控更活跃；相同条件下SV-HUC-1细胞中ZnPc-PEG₂-VH032既不降解VHL也不改变p-CDK2/4水平。综上，摄取差异及VHL调控活性差异共同促成了该化合物的肿瘤细胞选择性杀伤。

⑦ZnPc-PEG₂-VH032的体内抗肿瘤活性评价

NMIBC占膀胱癌75-80%，MMC为其一线化疗药物。研究建立NMIBC小鼠模型，首先验证ZnPc-PEG₂-VH032在MB-49细胞中保持低暗毒性和高光毒性。体外照射模型证实LED光源可穿透皮肤、皮下脂肪和膀胱组织有效激发药物产生ROS。采用mCherry-MB-49细胞建立原位模型后，比较给药途径：膀胱灌注使药物主要蓄积于膀胱而避免主要器官分布，尾静脉注射则相反，故选择膀胱灌注。小鼠随机分为PBS对照、ZnPc-PEG₂-VH032、MMC和ZnPc-PEG₂-VH032+光照组，治疗10天后分析：ZnPc-PEG₂-VH032组与PBS组荧光强度相似，表明无光照时无抗肿瘤活性；MMC组和ZnPc-PEG₂-VH032+光照组荧光几乎消失，疗效相当。病理切片显示ZnPc-PEG₂-VH032+光照组肿瘤基本消除，膀胱组织结构正常，证实安全性。治疗期间小鼠体重稳定。体内结果证实该药物光控特异性及良好的安全性与抗肿瘤活性。

本研究首次证明了VHL作为肿瘤精准治疗靶点的潜力。通过将单取代锌酞菁与VHL靶蛋白配体VH032相结合，研究合成并筛选出首个兼具高PI（36,397）和高SI（749）特征的PDTAC——ZnPc-PEG₂-VH032。该化合物利用VHL在T24细胞中较SV-HUC-1细胞对CDK2/4更为活跃的调控作用，以及T24细胞对ZnPc-PEG₂-VH032更强的摄取能力，实现了选择性肿瘤细胞杀伤。该研究不仅为开发选择性杀伤肿瘤细胞的药物提供了新靶点，也开创了兼具高PI和高SI特征的PDTAC研究新方向。

文献详细全面信息请跳转原文阅读：

https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2026.118736