【Nat. Catal.】南京大学黄小强/厦门大学王斌举/深圳先进院周佳海:协同硫胺素依赖的自由基生物催化与光氧化还原催化实现不对称C-C键形成

背景介绍

富含C(sp³)-立体中心的手性分子在新药研发中具有重要价值，其中自由基介导的C(sp³)-C(sp³)键构筑是一种极具潜力的合成策略。然而，在传统化学催化中，对两个潜手性烷基自由基的化学选择性和立体选择性（特别是对映选择性）重组是巨大的挑战。自然界中的酶以其卓越的选择性和可进化性，为调控自由基反应提供了独特优势，但此前报道的酶促自由基反应主要聚焦于C(sp²)-C(sp³)键形成，而实现远程、对映选择性的C(sp³)-C(sp³)键形成的“非天然”酶促反应仍是未知领域。

研究思路

本研究的核心思路是重新设计并协同利用硫胺素二磷酸（ThDP）依赖酶与光氧化还原催化。具体而言，通过光诱导的单电子转移（SET）过程，将传统上通过两电子极性历程（形成Breslow中间体）催化醛缩合的ThDP酶，重塑为能够通过自由基历程催化反应的非天然催化剂。研究者选择来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶（PpBFD）作为起始酶，与光催化剂罗丹明B（RhB）协同作用。肉桂醛衍生物在酶活性中心与ThDP-酶结合生成烯醇中间体，该中间体被光激发的RhB*氧化生成持久性的酶结合β-烯氧基自由基中间体。同时，还原态的光催化剂（RhB•⁻）还原另一自由基前体（如Katritzky盐）产生苄基自由基。这两种自由基在酶的活性口袋内发生交叉偶联，最终立体选择性地形成C(sp³)-C(sp³)键，生成带有β-或β,γ-立体中心的手性羧酸产物。

条件优化

研究者首先以肉桂醛1a和苄基Katritzky盐2a为模型底物，筛选了一系列ThDP依赖酶，发现野生型PpBFD能够以40%的产率和67%的ee值得到目标产物3a，且具有优异的化学选择性，未检测到常见的ipso-C(sp²)-C(sp³)偶联副产物。随后，通过定向进化对PpBFD进行改造以提高反应活性和对映选择性。通过定点饱和突变、丙氨酸扫描、聚焦理性迭代定点突变等策略，最终获得了最佳突变体RE1Csp3（包含A460G、L109F、T377L突变），其催化模型反应的产率达64%，对映选择性高达93%。控制实验证实了酶、ThDP辅因子、绿光光照和无氧环境对反应的必要性。

底物拓展

基于优化后的光生物催化体系，研究者系统地评估了底物范围。对于仅一个前手性自由基的情形，该反应可兼容多种对位、邻位、间位取代的肉桂醛以及萘基、噻吩基、吡啶基取代的醛，以中等到良好的产率（27-64%）和优异的对映选择性（90-96% ee）生成相应的手性羧酸。同时，一系列易于制备的苄基Katritzky盐也能顺利反应，以高对映选择性得到产物。研究还成功将该反应拓展至仲烷基和叔烷基自由基前体。通过进一步的蛋白工程，获得了突变体RE4Csp3（A460G_L109F_T377I_H281F），在构建含有两个连续立体中心的手性羧酸时，可同时实现良好的产率、优异的对映选择性（94% ee）和令人满意的非对映选择性（d.r. 89:11）。此外，利用N-(酰氧基)邻苯二甲酰亚胺类前体，成功构建了全碳季碳立体中心。该反应成功进行了克级规模制备，立体选择性得以保持。

机理研究

机理研究通过蛋白晶体结构、紫外-可见吸收光谱、低温电子顺磁共振、分子动力学和QM/MM计算等手段得以阐明。晶体结构显示，突变体RE1Csp3的关键位点突变导致活性口袋显著收缩，这可能是其对映选择性提高的结构基础。光谱分析证实了酶结合烯醇中间体的形成。低温EPR检测到了酶结合的有机自由基信号，支持了关键自由基中间体Int.III的存在。通过使用TEMPO自由基捕获剂，成功捕获了游离的苄基自由基Int.IV。QM/MM计算表明，在立体选择性的自由基-自由基交叉偶联步骤中，Int.IV在活性口袋中存在“朝上”和“朝下”两种构象，其中“朝上”构象与Int.III的结合能更低，其π-π堆积相互作用更有利，导致生成(R)-构型产物的能垒比生成(S)-构型低约3.6 kcal/mol，这与实验观察到的对映选择性相符。计算还表明，该反应中C(sp³)-C(sp³)键形成（vs. 先前报道的C(sp²)-C(sp³)偶联）的化学选择性主要受活性口袋的空间位阻效应控制。

总结

本研究通过将光氧化还原催化与工程化的ThDP依赖酶协同，成功开发了一种全新的、高度对映选择性（在某些情况下也可实现非对映选择性）的C(sp³)-C(sp³)键自由基交叉偶联反应。该工作突破了传统ThDP酶的两电子反应范式，首次利用酶精准控制了由光氧化还原过程生成的两种潜手性自由基之间的立体选择性重组。通过定向进化，成功优化了酶的活性和选择性，构建了广泛的带有有价值立体中心的分子库。这项工作不仅拓展了自由基生物催化的反应边界，也为利用酶催化剂解决化学催化中长期存在的选择性控制难题提供了新范式。

文献详情

作者：Jianlin Chun, Yuyan Bao, Qiaoyu Zhang, Xueli Hou, Zhouping Wu, Hailong Sun, Zhongqiu Xing, Bin Chen, Zihan Zhang, Yue Zhao, Jiahai Zhou, Binju Wang, Xiaoqiang Huang

题目：Enantioselective C(sp³)–C(sp³) bond formation by synergistic thiamine-dependent radical biocatalysis and photoredox catalysis

期刊：Nature Catalysis

DOI：10.1038/s41929-026-01515-w

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