化学发光成像无需外部激发光源，因而具备极低背景、高信噪比及深层组织穿透能力，为荧光成像提供了强有力的替代方案。在已知的化学发光团中，Schaap金刚烷亚基-1,2-二氧杂环丁烷类发光团因其在酚保护态下的相对稳定性以及对特定分析物的选择性激活特性而尤为引人注目，因此在生物医学领域的分析和诊断工具方面具有巨大应用潜力。
在设计 Schaap 化学发光分子时，必须充分考虑其发射波长、发射强度及稳定性等综合性能，而这些性能主要取决于其共轭骨架的结构。延长发射波长有助于减少组织对光的散射和吸收，从而提升组织穿透深度和成像信噪比。高化学发光强度可提供更优的成像质量，并有助于降低所需探针剂量，进而减少副作用。稳定性亦是探针的重要考量因素，良好的储存稳定性更有利于运输和临床转化。众所周知，近红外波段，尤其是波长大于 1000 nm 的第二近红外区，由于组织散射和吸收更弱，比可见光区更适于活体光学成像。如图 1a 所示，目前已通过两种策略实现了发射近红外光的 Schaap 化学发光团。其一是基于化学发光共振能量转移的间接近红外化学发光。然而，该策略需满足能级匹配条件，且能量转移过程中存在不可避免的能量损失，因此其化学发光量子产率通常较低。另一种机制为直接化学发光，即通过合理的分子工程手段——如引入强吸电子基团、杂原子取代以及拓展 π 共轭体系——来实现近红外发射（图 1b 及表 S1）。与间接机制相比，直接化学发光无需经历能量转移过程，因而具有更高的化学发光量子产率。在稳定性方面，二氧杂环丁烷结构的存在使 Schaap 化学发光团处于亚稳态。Shabat 课题组的研究工作表明，随着 Schaap 化学发光团共轭骨架的增大，其稳定性会随之下降。一种合理的机理解释是，扩展 π 体系最低未占分子轨道中的电子更易转移至过氧键的反键轨道，诱导其断裂，从而引发二氧杂环丁烷分解为苯甲酸酯衍生物和金刚烷酮。正因如此，该课题组报道的一种近红外发射半菁类化学发光团稳定性极差，须在制备后立即使用。或许基于相同原因，通过引入六次甲基链构建的第二近红外化学发光团也仅表现出有限的稳定性。此外，这些长波长发射化学发光团的合成过程相当复杂且繁琐。因此，如何通过相对简便的步骤制备长波长、相对稳定的 Schaap 化学发光团，仍然是一项严峻挑战。
本文中，作者提出了一种用于构建相对稳定的近红外发射型 Schaap 化学发光团的全新设计策略：以 2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈作为吸电子受体，同时引入噻吩及其衍生物作为 π 共轭桥联单元。如图 1c 所示，作者合成了四种化学发光团（ACHCL、ACHTCL、ACHTTCL 和 ACHBTCL），其酚羟基均由可被 H₂S 裂解的 2,4-二硝基苯磺酸酯基团保护。其中，基于噻吩并[3,2-b]噻吩和 2,2'-联噻吩桥联单元的分子，其发射波长被有效拓展至第二近红外区。令人鼓舞的是，即便共轭结构得到扩展，这些分子的稳定性并未受到显著影响——在室温下储存三个月后，仍有超过 70% 的化学发光分子保持其原有结构。如此优异的储存稳定性对于运输及终端应用极为有利。为评估其应用潜力，作者利用肿瘤微环境中异常升高的 H₂S 水平，实现了化学发光的肿瘤特异性激活，并将其作为造影剂用于肿瘤检测。这些近红外 Schaap 化学发光团展现出强发射信号及高成像信噪比，能够实现精准的肿瘤诊断，并可用于化学发光成像引导的手术导航，以辅助深部肿瘤的完整切除（图 1d）。
图 1. 构建近红外发射型 Schaap 化学发光团的一般策略及活体化学发光成像示意图。（a）间接化学发光与直接化学发光机理对比图。（b）已报道的代表性近红外发射型 Schaap 化学发光团的化学结构。（c）本工作所开发的化学发光团的化学结构。（d）化学发光团的 H₂S 激活机制及其在精准肿瘤诊断与化学发光成像引导下深部肿瘤切除手术导航中的应用。（NPs，纳米颗粒）
图 2. 化学发光团的光学性质。（a）ACHCL、ACHTCL、ACHTTCL 和 ACHBTCL（50 μM）在含 1% 二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液中，未加入或加入硫氢化钠（100 μM）时的化学发光光谱。（b）ACHCL 纳米颗粒、ACHTCL 纳米颗粒、ACHTTCL 纳米颗粒和 ACHBTCL 纳米颗粒（化学发光团浓度 = 50 μM，除非另有说明，下文中纳米颗粒均采用此浓度表述）在磷酸盐缓冲液中，未加入或加入 NaHS（100 μM）时的化学发光光谱。（c）ACHCL 纳米颗粒、ACHTCL 纳米颗粒、ACHTTCL 纳米颗粒和 ACHBTCL 纳米颗粒（50 μM）在磷酸盐缓冲液中，未加入或加入 NaHS（100 μM）时的化学发光动力学光谱。（d）ACHCL 纳米颗粒、ACHTCL 纳米颗粒、ACHTTCL 纳米颗粒和 ACHBTCL 纳米颗粒（50 μM）在磷酸盐缓冲液中与不同活性氧物种、生物硫醇及金属离子（100 μM）共孵育后的化学发光与荧光信号强度增强倍数（n = 5 次独立实验）。（e）ACHCL、ACHTCL、ACHTTCL 和 ACHBTCL（50 μM）与 NaHS（100 μM）孵育 1 小时前后的高效液相色谱曲线。
图 3. 化学发光团的理论计算。（a）活化后呈苯甲酸酯形式的化学发光团的化学结构。（b）活化后化学发光团的基态（S₀）与激发态（S₁）优化几何构型。（c）基态（S₀，粉色）与激发态（S₁，蓝色）几何构型的结构叠合对比及相应的均方根偏差值。
图 4. 对 H₂S 的成像深度与检测限。（a）ACH TTCL 纳米颗粒（50 μM）在含 1% 脂肪乳的磷酸盐缓冲液中，不同深度下的化学发光（上图）与荧光（下图）成像图（n = 5 次独立实验）。（b）图（a）中 ACHTTCL 纳米颗粒的化学发光与荧光图像信噪比随穿透深度的变化曲线。（c）ACHCL 纳米颗粒（50 μM）在含 1% 脂肪乳的 PBS 中，不同深度下的化学发光（上图）与荧光（下图）成像图（n = 5 次独立实验）。（d）图（c）中 ACHCL 纳米颗粒的化学发光与荧光图像信噪比随穿透深度的变化曲线。（e）ACH TTCL 与 ACHCL 纳米颗粒（50 μM）在 PBS 中，未加入或加入不同浓度 NaHS 时的化学发光成像图（n = 5 次独立实验）。（f, g）ACH TTCL 纳米颗粒（f）与 ACHCL 纳米颗粒（g）的平均化学发光强度对 NaHS 浓度（0–100 μM）的线性拟合曲线。
图 5. 细胞毒性及细胞内 H₂S 激活成像。（a, b）HaCaT 细胞（a）与 HeLa 细胞（b）经不同浓度 ACHTTCL 纳米颗粒或 ACHCL 纳米颗粒孵育 24 小时后的细胞活力（n = 5 次独立实验）。（c）HaCaT、HeLa 及经 AOAA 预处理的 HeLa 细胞与 5 μM ACHTTCL 纳米颗粒或 ACHCL 纳米颗粒共孵育 15 分钟后的化学发光图像及其信噪比；化学发光图像采用 IVIS 成像系统采集（AOAA 预处理条件：0.5 mM 处理 2 小时，n = 5 次独立实验）。（d, f）HaCaT 与 HeLa 细胞与 5 μM ACHTTCL 纳米颗粒（d）或 ACHCL 纳米颗粒（f）共孵育 30 分钟后的共聚焦荧光图像（n = 10 次独立实验）。比例尺：10 μm。（e, g）分别根据图（d）和（f）中的共聚焦荧光图像计算所得的单细胞荧光强度。
图 6. 皮下 4T1 荷瘤小鼠的活体成像。（a, b）皮下 4T1 荷瘤小鼠经瘤内注射 ACHTTCL 纳米颗粒（a）或 ACHCL 纳米颗粒（b）（50 μM，50 μL PBS 溶液）后的实时化学发光与荧光成像（n = 5 次独立实验）。（c, d）根据皮下 4T1 荷瘤小鼠瘤内注射 ACHTTCL 纳米颗粒（a）或 ACHCL 纳米颗粒（b）后的实时化学发光与荧光图像计算所得的信噪比（n = 5 次独立实验）。（e）在化学发光引导下切除的肿瘤组织 H&E 染色切片图像。比例尺：100 μm。
图 7. 4T1 肺转移荷瘤小鼠的活体成像。（a）4T1 肺转移小鼠体内成像实验流程示意图。（b, c）4T1 肺转移小鼠经气管内注射 ACHTTCL 纳米颗粒（b）与 ACHCL 纳米颗粒（c）后 15 分钟的活体化学发光及荧光成像图，同时展示离体肺脏的化学发光、荧光及明场图像（比例尺：0.5 cm）及其 H&E 染色切片（比例尺：1.0 mm）（n = 5 次独立实验）。
图 8. 4T1 腹膜转移荷瘤小鼠的活体成像。（a）化学发光成像引导肿瘤手术的实验流程示意图。（b, c）注射 ACHTTCL 纳米颗粒（b）与 ACHCL 纳米颗粒（c）后的 4T1 腹膜转移荷瘤小鼠，在开腹前、开腹后且肿瘤切除前（术前）、首次非引导手术后（非引导第 1 次术后）以及第二次手术（化学发光成像引导第 2 次术后）情况下的化学发光与荧光图像（n = 5 次独立实验）。比例尺：0.5 cm。（d）ACHTTCL 纳米颗粒组与 ACHCL 纳米颗粒组中，首次及第二次手术切除的肿瘤尺寸。灰色线表示数据均值。（e）ACHTTCL 纳米颗粒组与 ACHCL 纳米颗粒组中，第二次手术切除的残余肿瘤组织的信噪比。灰色线表示数据均值。（f）ACHTTCL 纳米颗粒组与 ACHCL 纳米颗粒组第二次手术切除的肿瘤组织 H&E 染色切片图像（n = 5 次独立实验）。比例尺：100 μm。
作者合成了四种 Schaap 化学发光团——ACHCL、ACHTCL、ACHTTCL 和 ACHBTCL，其设计策略为：以 2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈作为电子受体，引入噻吩及其衍生物作为 π 共轭桥联单元，并采用 2,4-二硝基苯磺酸酯基团对酚羟基进行保护。其中，基于噻吩并[3,2-b]噻吩和 2,2'-联噻吩桥联的分子，其发射波长被拓展至第二近红外区。值得关注的是，这四种化学发光团均表现出优异的储存稳定性：在室温下放置三个月后，仍有超过 70% 的分子保持结构完整，这极大简化了储存、运输及后续临床转化环节。理论计算结果表明，拓展 π 共轭可使化学发光发射发生红移，而增强分子刚性则有助于提高发射效率，为设计长波长、高性能探针提供了理性框架。以这些化学发光团作为造影剂，作者实现了 H₂S 激活型化学发光成像。其中，具有更长发射波长的 ACHTTCL 纳米颗粒展现出更优的性能，包括更高的信噪比和更深的组织穿透能力，能够实现精准的肿瘤定位以及对肉眼不可见微小肿瘤（<2 mm）的完整切除。本工作凸显了理性分子设计、理论指导与化学发光成像相结合在深部组织肿瘤精准检测及图像引导手术中的协同优势，为开发高性能近红外化学发光探针提供了蓝图。
文献链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c03574
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