IF=10.7,南京大学基于高通量筛选获新型【NLRP3抑制剂CeeNU】!从表型到分子位点,老药新用挖掘炎症小体调控新分子

现有NLRP3抑制剂多聚焦于功能抑制，对药物与靶点的直接结合位点解析不足。研究以高通量筛选为核心技术，以CeeNU为研究分子，通过直接靶向NLRP3、阻断复合物组装的方式，调控NLRP3介导的焦亡通路，通过高通量筛选（表型）→靶点确证（DARTS/CETSA/SPR）→结合位点定位（分子对接+点突变）→体内功能评估（EAE模型）的完整研究闭环，从分子、细胞到动物层面系统阐明CeeNU的作用机制。研究不仅完善了NLRP3炎症小体的小分子调控网络，为细胞焦亡相关炎症机制研究提供新的分子工具，也建立了一套可复制的老药新用+炎症靶点筛选研究范式，为NLRP3相关研究提供全新思路与理论支撑！

1. 高通量筛选：采用CellTiter‑Glo法对2747种已获批化合物高通量筛选，以脂多糖/尼日利亚菌素（LPS/nigericin）诱导NLRP3焦亡模型，筛选可抑制NLRP3活化的小分子化合物。

2. 细胞表型验证：在人/小鼠巨噬细胞、小胶质细胞中，验证CeeNU对NLRP3活化、焦亡及炎症因子释放的调控作用，明确作用有效性。

3. 特异性鉴定：检测CeeNU对AIM2、NLRC4炎症小体及上游信号的影响，明确其对NLRP3炎症小体的作用特异性。

4. 分子互作与位点解析：通过蛋白互作、分子对接、位点突变实验，解析CeeNU与NLRP3的结合结构域与关键氨基酸位点。

5. 体内模型验证：构建多种小鼠体内模型，验证CeeNU对NLRP3介导炎症反应与病理损伤的调控作用。

采用CellTiter-Glo法对2747种化合物进行高通量筛选，发现CeeNU可显著改善LPS/nigericin诱导的THP-1细胞焦亡相关损伤，在≤150 μM浓度下无明显细胞毒性，调控作用呈剂量依赖性。

在LPS预处理的THP-1细胞中，CeeNU呈剂量依赖性地减少nigericin或MSU诱导的IL-1β分泌和LDH释放。Western Blot显示其抑制caspase-1和GSDMD的切割，电镜结果证实其显著减少了细胞膜孔的形成。

CeeNU处理可显著降低小鼠BMDM细胞中由ATP或尼日利亚菌素触发的IL-1β释放与LDH泄漏。免疫印迹结果进一步证实，CeeNU有效抑制了caspase-1(p20)和GSDMD-NT的产生，且对NLRP3和pro-IL-1β基础表达无影响。

CeeNU处理不影响poly(dA:dT)或鞭毛蛋白激活的AIM2与NLRC4炎症小体，表明其选择性作用于NLRP3。在Nlrp3^-/-和Gsdmd^-/- BMDM中，CeeNU对IL-1β和LDH的抑制作用消失，证实其依赖于NLRP3-GSDMD通路。

免疫荧光显示CeeNU抑制了ASC斑点的形成。化学交联实验表明，CeeNU剂量依赖性阻断ASC寡聚化。Co-IP结果证实，CeeNU处理破坏了NLRP3与NEK7的蛋白相互作用，这是抑制NLRP3组装的关键步骤。

CETSA和DARTS实验证实CeeNU直接结合NLRP3并增强其热稳定性。SPR测定其结合亲和力KD为19.26 μmol/L。分子对接和点突变实验确定，CeeNU通过与NLRP3 NACHT结构域的Arg335(R335)形成氢键而发挥作用。

在MSU诱导的腹膜炎模型中，CeeNU处理减少腹腔中性粒细胞和单核细胞数量，并降低IL-1β和IL-6水平。在痛风性关节炎模型中，CeeNU减轻了关节肿胀，减少了组织损伤和caspase-1活性。

CeeNU干预显著降低EAE模型小鼠的临床评分。脊髓LFB与H&E染色显示，CeeNU减少了免疫细胞浸润与髓鞘脱失。流式分析表明，CeeNU减少了脑内CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润及炎症因子表达。