生物通道镶嵌在细胞膜内，能够对外部刺激做出快速、连续的响应以调节离子传输，这在调控细胞生理和病理过程中起着至关重要的作用 。然而，在人工系统中复制这种精妙的生物通道，尤其是开发能够快速、可逆地捕获和释放分子以进行动态单细胞分析的仿生跨膜纳米通道，一直是一项巨大的挑战 。
近日，南京大学化学化工学院的叶德举、徐静娟及赵伟伟团队在国际顶级纳米期刊《ACS Nano》上发表了一项重要研究 。他们将阳离子硅取代罗丹明（SiRh）探针与石英纳米移液管巧妙结合，开发出一种具有快速（1秒内）、可逆响应特性的仿生跨膜纳米通道，用于单细胞内谷胱甘肽（GSH）的动态定量分析 。该研究的一个关键发现是：利用GSH与SiRh之间快速且可逆的亲核加成反应，纳米通道内表面的电荷可以在正负之间翻转，从而实现了离子电流整流（ICR）信号的显著且可逆的开关响应 。
纳米移液管因其极高的生物相容性和易于功能化的特点，被视为理想的仿生离子通道工具 。在这项研究中，作者首先制备了尖端内径约为250 nm的石英纳米移液管，并通过化学偶联反应将SiRh固定在通道内壁 。
GSH 敏感型的 SiRh 纳米通道具有快速响应和可逆性的特点。在存在 GSH 的情况下，巯基与罗丹明（二芳基碳正离子）之间的特定亲核攻击能够在 1 秒内导致纳米滴管内表面电荷的反转，这可以通过阳离子传输闸门从“关闭”状态转变为“开启”状态来体现。
图1. 仿生纳米通道的构建原理及其响应GSH引起离子门控切换的示意图
在缓冲液测试中，该传感器展现出了卓越的分析性能。随着GSH浓度从0.1 mM增加至20 mM，在-1.0 V下的离子电流呈阶梯式增加，离子门控比与GSH浓度呈良好的线性关系 。更为重要的是，通过交替加入GSH和不可逆的硫醇清除剂N-乙基马来酰亚胺（NEM），该纳米通道的电流信号能够完美地在多个循环中恢复，证明了其优异的可逆性和重复使用潜力 。
图2. 纳米通道对GSH的浓度响应、选择性及可逆性验证
该研究最核心的亮点在于其展示了纳米移液管在活单细胞原位、动态追踪中的强大能力。为了实现高时空分辨的单细胞探测，研究人员搭建了集光学成像与精密微操纵于一体的实验系统： 细胞被接种于含有1 mL DMEM培养基的35 mm玻璃底培养皿中 。在Nikon Ti2-E倒置显微镜的观察下，借助Sutter MP-225高精度三维微操纵器，纳米通道被精准刺入单个活细胞的细胞质中 。随后，系统以100 kHz的高采样频率在-1.0 V至+1.0 V之间进行电压扫描以记录电生理信号 。
在动态连续监测实验中，通道插入细胞后，向培养基中加入终浓度为 $500\ \mu M$ 的NEM，纳米通道精准捕捉到胞内GSH在5分钟内从约 5.4 mM 锐减至 1.9 mM；随后清洗并换上含有 5 mM GSH(Et)（GSH前体）的新鲜培养基，胞内GSH水平在5分钟内重新回升至约 3.1 mM 。此外，在光动力治疗（PDT）实验中，细胞与 10 uM的光敏剂（Zn-PPa）孵育12小时，并在 40 mW/cm2 的671 nm激光下照射1分钟 。借助微操纵，纳米探针分别探测了细胞质和光照诱导产生的孤立“囊泡”，精准揭示了囊泡内的GSH水平（约 2.4 mM）显著低于光照后的细胞质（约 3.3 mM） 。
图3. 活细胞内的精密跨膜操作、GSH动态追踪以及光动力治疗（PDT）下的空间分辨探测
最后，研究人员将该单细胞记录系统应用于监测铁死亡（Ferroptosis）过程中的GSH稳态演变。将不同癌细胞暴露于 10 uM的铁死亡诱导剂Erastin中进行长时间孵育 。结果显示，在处理8小时后，基础GSH水平较高的SK-BR-3细胞其GSH下降了约44%，而基础GSH水平较低的MDA-MB-435细胞则大幅下降了约65% 。这在单细胞层面直观证实了低GSH表达的癌细胞对铁死亡诱导剂更为敏感 。
图4. 铁死亡诱导过程中不同癌细胞系内GSH稳态的时空监测
点评和总结：
这项研究成功地将快速可逆的荧光探针化学与高精度的纳米通道技术相结合，打造了一款具有亚秒级响应能力的仿生纳米传感器。该工作详尽展示了单细胞微操纵平台中光学显微、纳米级三维定位与高频电生理记录的深度融合。这种无损、原位的跨膜探测策略不仅克服了传统荧光探针在连续动态监测上的局限，更为未来在单细胞或亚细胞层面上、高时空分辨率地解析各类内源性代谢物的动态调控网络提供了卓越的实验范本与技术指导。
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Liu, Y.-L.; Yu, S.-Y.; An, R.; Miao, Y.; Jiang, D.; Ye, D.; Xu, J.-J.; Zhao, W.-W.* A Fast and Reversible Responsive Bionic Transmembrane Nanochannel for Dynamic Single-Cell Quantification of Glutathione.
ACS Nano 2023, 17, 17468-17475. doi:10.1021/acsnano.3c05825
