PBJ | 南京农大百合科研团队解析LlPLATZ1/LlMYB4-LlHSF24调控模块维持百合热胁迫响应动态平衡的分子机制

1.      LlPLATZ1是一个热诱导的PLATZ转录因子

在百合叶片中的表达分析表明，LlPLATZ1在热胁迫处理后0.5 h即被快速诱导表达，在1 h时表达量达到峰值，表明LlPLATZ1受高温瞬时激活(图1a)。作者分离了LlPLATZ1的启动子区域，分析了其在高温条件下的活性。将LlPLATZ1启动子驱动的Luc报告基因瞬时转化烟草叶片。热胁迫后，Luc活性显著升高(图1b,c)。此外，作者将LlPLATZ1-GUS瞬时转化百合花瓣。与正常条件相比，高温胁迫处理增强了GUS的强度，表明高温促进了LlPLATZ1启动子的活性。在热胁迫条件下，GUS活性显著高于对照条件(图1d,e)，表明热胁迫激活LlPLATZ1启动子活性。根据这些结果，推断LlPLATZ1是一个热诱导的PLATZ转录因子。

2.      LlPLATZ1作为转录抑制因子发挥作用

在正常或热胁迫条件下，LlPLATZ1均定位于细胞核(图1f)。此外，荧光显微镜和免疫印迹分析表明，LlPLATZ1在短暂和长期热胁迫(图1f,g)下积累。这些结果表明LlPLATZ1能够在不同的热胁迫条件下发挥作用。利用酵母实验系统检测了LlPLATZ1的转录活性。结果显示，LlPLATZ1转化的酵母细胞不能在缺素培养基(SD)上生长(图1h)，利用VP16报告系统进一步分析发现，转化LlPLATZ1-VP16的酵母在缺素培养基上的生长情况弱于转化VP16的酵母。这表明LlPLATZ1抑制了VP16的激活功能(图1i)。此外，对转化酵母中β-半乳糖苷酶活性的检测表明，LlPLATZ1-VP16融合蛋白减弱了VP16对β-半乳糖苷酶表达的激活作用(图1j)。这些结果表明LlPLATZ1在酵母细胞中作为转录抑制子发挥作用。此外，利用双荧光素酶报告系统在烟草叶片中检测了LlPLATZ1在植物细胞中的转录能力(图1k)。结果表明，与表达BD相比，BD-LlPLATZ1表达抑制了UAS驱动的Luc报告基因的活性。同样，在表达LlPLATZ1-VP16的区域，Luc信号弱于单独表达VP16(图1l,m)。这些结果表明LlPLATZ1在植物细胞中也显示出转录抑制活性。

3.      LlPLATZ1直接结合LlHSF24的启动子并抑制其表达

在百合花瓣圆片中过表达LlPLATZ1进行转录组分析。分析发现过表达LlPLATZ1导致891个基因表达上调，765个基因表达下调。其中，一个B类HSF，LlHSF24，被观察到显著地下调表达(图2a)。进一步进行表达分析，证实LlPLATZ1过表达抑制了百合中LlHSF24的积累(图2b)。Y1H实验表明LlPLATZ1与LlHSF24启动子的A/T-rich片段特异性结合(图2c,d)。EMSA表明，LlPLATZ1在体外与LlHSF24启动子富含A/T元件的标记探针具有结合亲和力(图2e)。ChIP-qPCR实验进一步提供了体内LlPLATZ1与LlHSF24启动子区域结合的证据(图2f)。双荧光素酶报告基因实验表明，与对照相比，在烟草叶片中瞬时过表达LlPLATZ1抑制了LlHSF24启动子驱动的Luc活性。这些结果表明LlPLATZ1通过直接结合LlHSF24的启动子抑制其表达(图2g,h)。

4.      LlPLATZ1赋予百合耐热性

通过农杆菌介导的转化百合胚性愈伤组织间接再生的方式获得了三个LlPLATZ1转基因百合株系，随后的生长表型分析显示过表达LlPLATZ1显著限制了百合的生长。表达分析发现，LlPLATZ1在这些转基因株系中表达升高，而LlHSF24表达降低(图3a,b)。热胁迫后，LlPLATZ1转基因组培幼苗的表型较野生型植株有所改善，具有较低的相对离子渗透率和较高的叶绿素积累(图3c-e)。同时还检测了盆栽转化百合的耐热性，热胁迫处理后，转基因植株表现出萎蔫和叶片褪绿现象减轻(图3f)。转基因植株叶片的相对离子渗透率受热胁迫影响较小，其叶绿素含量减少也较低 (图3g,h)。DAB和NBT染色分析表明，热胁迫后，转基因株系积累了较低水平的ROS，表明过表达LlPLATZ1减轻了百合细胞热诱导的损伤(图3i,j)。

5.      LlHSF24负调控百合耐热性

利用VIGS方法在百合植株中沉默LlHSF24(图5a)。与TRV-control相比，沉默LlHSF24导致百合叶片在高温胁迫后具有较低的相对离子渗漏和较高的叶绿素积累的耐热表型(图5b-d)。此外，高温胁迫后，LlHSF24沉默植株叶片中ROS积累较少(图5e,f)。热保护基因LlHSP22.0和LlHSP70在LlHSF24沉默植株中上调表达(图5g,h)。双荧光素酶报告基因实验表明LlHSF24抑制LlHSP22.0和LlHSP70启动子的活性(图5i-l)，表明LlHSF24通过抑制热保护基因发挥耐热负调控作用。

6.      LlMYB4与LlPLATZ1蛋白互作

利用酵母双杂交(Y2H)文库筛选到LlPLATZ1的一个潜在互作蛋白MYB4。Y2H实验结果表明，LlPLATZ1与LlMYB4存在互作(图6a)。体外pull-down实验证明GST-LlPLATZ1蛋白与HIS-LlMYB4蛋白能够结合(图6b)，证实LlPLATZ1与LlMYB4是直接的物理互作。LCI分析显示，在LlPLATZ1和LlMYB4共表达的烟草叶片区域有明显的Luc信号，表明它们在体内也存在互作(图6c)。BiFC分析表明，LlPLATZ1与LlMYB4的互作在正常和热胁迫条件下均稳定存在于细胞核中，与LlMYB4定位于细胞核中并积累的观察结果一致(图6d)。随后，利用Co-IP技术分析高温对烟草叶片中LlPLATZ1-LlMYB4互作的影响。结果显示，热胁迫处理并未影响LlPLATZ1和LlMYB4的蛋白积累(图6e)；然而，在热胁迫条件下，LlPLATZ1-LlMYB4的蛋白互作增强(图6e)。这些结果表明，LlPLATZ1与LlMYB4蛋白互作，且高温能够促进LlPLATZ1与LlMYB4的互作。

7.      LlMYB4直接激活LlHSF24和拮抗LlPLATZ1的功能

表达分析表明，LlMYB4不受瞬时高温的诱导，但受长时间高温的激活 (图7a)。Y1H实验表明LlMYB4能够结合LlHSF24启动子(图7b,c)。进一步分析LlHSF24启动子，发现一个保守的MYB结合元件(图7b)。EMSA证实LlMYB4在体外可以结合含有MYB结合元件的标记探针 (图7d)。ChIP-qPCR实验进一步证实LlMYB4在体内结合到LlHSF24启动子上含有MYB结合元件的区域(图7e)。在双荧光素酶报告基因实验中，LlPLATZ1对LlHSF24的启动子活性具有抑制作用，而LlMYB4对其活性具有激活作用；值得注意的是，LlPLATZ1和LlMYB4共表达导致抑制活性降低(图7f-i)。这些结果表明，LlMYB4激活LlHSF24并与LlPLATZ1互作来调节其抑制作用。