南京中医药大学 | 从中药木香到精准靶点:AI 驱动发现肾纤维化治疗新候选药物

研究背景

慢性肾病（CKD）全球患病率超 8.4 亿，死亡率持续上升，肾纤维化是 CKD 进展的核心病理标志，以细胞外基质过度沉积、肾小管上皮间质转化（EMT）为特征，最终导致肾功能不可逆损伤。目前临床常用的 ARNI、SGLT2i 等药物疗效有限，缺乏特异性抗纤维化手段，研发新型安全有效的治疗药物迫在眉睫。中药因低毒高效的特点成为天然药物研发重要方向，丹参酮、姜黄素等中药活性成分虽被证实有抗肾纤维化潜力，但存在药效弱、机制不清等问题，限制临床转化。AI 技术凭借高效筛选优势，已逐步应用于中药靶点预测、活性成分挖掘，但现有模型难以深度融合多模态数据，亟需构建整合多源生物特征的 AI 模型，助力中药抗肾纤维化活性成分的精准发现与机制解析。

研究方法

• AI 模型构建：整合 369 味中药、73 个症状数据，用 Word2Vec 做语义嵌入，构建融合 BiLSTM 与跨模态注意力的 TCM-SPred 模型，10 折交叉验证评估模型性能，筛选抗肾纤维化中药。

• 活性成分提取：石油醚回流提取木香粗提物，硅胶柱层析、重结晶纯化得到 DCL，HPLC 鉴定纯度。

• 体外实验：TGF-β1 诱导 HK-2、TCMK-1 肾小管上皮细胞纤维化，检测 DCL 对纤维化、EMT、炎症标志物的影响；构建 IQGAP1 敲除 / 过表达、CCT3 敲除细胞模型，验证靶点功能。

• 体内实验：构建 UUO、叶酸诱导肾纤维化小鼠模型，灌胃 DCL 干预，HE、Masson 染色观察肾组织病理变化，检测肾功能及纤维化相关基因、蛋白表达。

• 机制验证：合成生物素标记 DCL 探针，通过 pull-down、LC-MS/MS 鉴定靶点；CETSA、SPR、PLA、共免疫沉淀等实验验证 DCL 与 IQGAP1 互作及下游通路调控。

研究结果

• AI 筛选结果：TCM-SPred 模型准确率超 97.16%，AUC 均值 0.95，筛选出木香为抗肾纤维化最优中药，评分 13.68。

• DCL 活性验证：体外实验显示 DCL（0.2-5μM）可显著抑制 TGF-β1 诱导的肾小管上皮细胞 EMT 及纤维化，降低炎症因子表达；体内实验中，1mg/kg DCL 可显著改善 UUO / 叶酸小鼠肾组织损伤、减少胶原沉积，疗效优于阳性药吡非尼酮。

• 靶点与机制：DCL 直接靶向 IQGAP1（Kd=37.2nM），共价结合其 Cys1534 位点；阻断 IQGAP1 与 CCT3 互作，抑制 Wnt 通路激活；肾小管上皮细胞特异性敲除 IQGAP1/CCT3 可显著缓解小鼠肾纤维化，Wnt 通路激活可逆转 IQGAP1 敲除的抗纤维化作用。

Figure 1：多模态 AI 模型 TCM‑SPred 整体架构与工作流程

该图展示了用于中药‑症状关联预测的多模态 AI 模型 TCM‑SPred 的完整设计框架，说明它如何把中药、靶点、症状、基因、蛋白互作等多源数据融合，通过深度学习自动捕捉潜在关联，从而高效筛选治疗肾纤维化的候选中药。流程从数据预处理开始：收集 369 味中药、73 种症状、25 万个靶点，构建高质量正负样本的中药‑症状关联库；接着做特征提取与嵌入：用 Word2Vec 把中药与症状做语义向量表示，再基于蛋白‑蛋白相互作用网络（PPI），把中药靶点与症状相关基因的关联也转为特征向量；随后进入神经网络核心：采用双向 LSTM + 跨模态注意力机制，动态融合多模态特征，自动学习中药与症状之间的深层对应关系；最后通过分类器输出预测结果，给出每味中药针对肾纤维化相关症状的匹配评分，实现对潜在有效中药的优先级排序，为后续实验验证提供可靠的候选名单。

Figure 2：TCM-SPred 模型性能及土木香抗肾纤维化潜力验证

该图从模型有效性、预测结果两方面，验证了多模态 AI 驱动的 TCM-SPred 模型可精准筛选抗肾纤维化中药，且土木香是高潜力候选药物。其中 A 图通过混淆矩阵分解，证明模型在肾纤维化症状数据集上分类准确率优异，真阳性率超 97.16%，无明显分类偏差；B 图 10 折交叉验证的 ROC 曲线显示模型 AUC 值在 0.92-0.97 之间、均值达 0.95±0.01，说明模型泛化能力和稳定性极强，不受数据集划分方式影响；C 图列出肾纤维化相关症状预测得分前十的中药，土木香以 13.68 的高分位列其中，凸显其与肾纤维化症状的强关联性；D 图进一步拆解前十味中药对 30 种肾纤维化相关症状的适配排名，发现土木香可作为 15 种症状的首选治疗药、12 种症状的次选治疗药，从多症状维度证实土木香对肾纤维化的干预潜力。

Figure 3：DCL 在体外肾小管上皮细胞模型中抗肾纤维化作用

该图从细胞形态、蛋白表达、基因表达层面，证实去氢木香内酯（DCL）可有效抑制 TGF-β1 诱导的肾小管上皮细胞纤维化和上皮 - 间质转化（EMT），且具有剂量依赖性。A 图免疫荧光染色结果显示，TGF-β1 诱导后 HK-2 细胞纤维化标志物 α-SMA 显著升高，而 DCL 处理后 α-SMA 表达随浓度增加明显降低，直观体现 DCL 抑制纤维化表型；B 图 Western blot 结果显示，TGF-β1 刺激使 HK-2 细胞上皮标志物 E-Cadherin 下调、间质标志物 VIM、α-SMA、SNAI1 上调，DCL 处理可逆转这一趋势，且 5μM 浓度效果最显著；C 图 qRT-PCR 结果进一步验证，DCL 能剂量依赖性抑制纤维化、肾损伤、EMT 及炎症相关基因的异常表达；D、E 图在小鼠肾小管上皮细胞 TCMK-1 中复现上述结果，证明 DCL 的抗纤维化作用无细胞种属特异性，核心靶向肾小管上皮细胞发挥保护作用。

Figure 4：DCL 在体内小鼠肾纤维化模型中的治疗效果

该图通过单侧输尿管梗阻（UUO）和叶酸（FA）诱导的小鼠肾纤维化模型，证实 DCL 可显著改善体内肾组织损伤、纤维化及 EMT，且疗效优于阳性对照药吡非尼酮。A 图为 UUO 模型给药方案，对小鼠实施 UUO 术后，连续 12 天灌胃不同剂量 DCL 或溶媒，用于评估剂量效应；B 图 HE 和 Masson 染色显示，UUO 模型小鼠肾组织出现萎缩、肾小管扩张、胶原大量沉积，DCL 处理可明显减轻上述病理改变，1mg/kg 和 10mg/kg 剂量效果突出；C 图免疫组化结果显示，DCL 可上调肾组织 E-Cadherin 表达、下调 α-SMA 表达，逆转体内 EMT 进程；D、E 图 Western blot 和 qRT-PCR 结果证实，DCL 能抑制 UUO 诱导的 EMT 标志物、促炎因子、肾损伤及纤维化相关因子的异常表达；F 图为不同疗程 DCL 与吡非尼酮对比的给药方案；G-I 图染色、蛋白及基因检测结果显示，DCL 治疗 4 天、8 天、12 天均能缓解肾纤维化，12 天疗程效果优于同疗程吡非尼酮；此外，FA 诱导的急性肾纤维化模型中，DCL 也可显著减轻肾损伤与纤维化，进一步佐证其体内抗纤维化的普适性。

Figure 5：DCL 直接靶向肾小管上皮细胞中的 IQGAP1 蛋白

该图通过化学探针、生物物理及分子生物学实验，层层验证 IQGAP1 是 DCL 抗肾纤维化的直接作用靶点，二者具有强特异性结合能力。A 图展示 3 种生物素标记的 DCL 亲和探针结构，用于后续靶点捕获；B 图检测 3 种探针抑制纤维化相关基因表达的效果，发现 Probe-DCL-1 抑制活性最强，确定其为后续实验用探针；C 图为靶点鉴定流程，通过探针标记、细胞裂解、链霉亲和素磁珠富集、质谱分析，筛选 DCL 结合蛋白；D 图免疫荧光共定位实验显示，Probe-DCL-3 与 IQGAP1 在 HK-2 细胞内共定位，提示二者在细胞内存在相互作用；E 图表面等离子体共振（SPR）实验测得 DCL 与 IQGAP1 的平衡解离常数 Kd=37.2nM，证明二者具有高亲和力；F 图 pull-down 实验显示，Probe-DCL-1 可特异性沉淀内源性 IQGAP1，游离 DCL 可竞争性阻断该结合，阴性探针则无法沉淀 IQGAP1，进一步证实结合特异性；G-I 图细胞热位移实验（CETSA）、溶剂诱导蛋白沉淀实验（SIP）及浓度梯度 CETSA 实验，从蛋白热稳定性、构象稳定性角度，证实 DCL 可直接结合并稳定 IQGAP1，且结合具有浓度依赖性。

Figure 6：IQGAP1 在肾纤维化中高表达且介导 TGF-β1 诱导的肾小管上皮细胞纤维化

该图从临床样本、动物模型、细胞实验三方面，证实 IQGAP1 在肾纤维化中异常高表达，且是 TGF-β1 诱导肾小管上皮细胞纤维化和 EMT 的关键介导因子。A 图 Nephroseq 数据库分析显示，慢性肾病（CKD）患者肾活检组织中 IQGAP1 mRNA 表达显著高于健康对照；B 图相关性分析表明，IQGAP1 表达水平与估算肾小球滤过率（eGFR）呈强负相关，提示 IQGAP1 表达越高，肾功能损伤越严重；C 图人肾组织免疫组化结果显示，肾纤维化患者肾组织 IQGAP1 蛋白表达远高于非纤维化患者，验证临床相关性；D-F 图 UUO 小鼠肾组织检测结果显示，模型组 IQGAP1 mRNA 和蛋白表达显著升高，免疫组化显示其在肾组织中高表达；G、H、I 图 IQGAP1 敲低实验显示，沉默 IQGAP1 可抑制 TGF-β1 诱导的 HK-2 细胞 α-SMA 表达，逆转 EMT 标志物异常，下调纤维化、炎症及肾损伤相关基因表达；J、K、L 图 IQGAP1 过表达实验显示，过表达 IQGAP1 会促进 TGF-β1 诱导的纤维化和 EMT，且可阻断 DCL 的抗纤维化作用，证实 IQGAP1 是 DCL 发挥作用的关键下游靶点。

Figure 7：DCL 与 IQGAP1 的结合位点定位

该图通过质谱分析、分子对接及定点突变实验，精准定位 DCL 与 IQGAP1 的共价结合位点为 IQGAP1 的 Cys1534 残基。A 图为结合位点鉴定流程，将 DCL 与纯化的 IQGAP1 共孵育后，经胰酶消化、质谱分析，筛选 DCL 修饰的肽段；B 图 LC-MS/MS 质谱图显示，肽段 1533-TCLDNLASK-1541 分子量增加 230.13，对应光活化 DCL 的修饰，锁定修饰位点位于该肽段内；C 图分子对接模拟结果显示，DCL 通过迈克尔加成反应与 IQGAP1 的 Cys1534 残基形成共价键，明确结合模式；D 图 pull-down 实验显示，IQGAP1 的 Cys1534 突变为 Ala（C1534A）后，Probe-DCL-1 无法有效沉淀突变型 IQGAP1，结合能力显著下降；E 图 CETSA 实验显示，C1534A 突变后，DCL 无法增强 IQGAP1 的热稳定性，证实 Cys1534 是 DCL 结合的关键残基；F、G 图功能验证实验显示，C1534A 突变会削弱 DCL 抑制 TGF-β1 诱导的 EMT 和纤维化的能力，从功能层面确认 Cys1534 是 DCL 发挥抗纤维化作用的必需结合位点。

Figure 8：IQGAP1 通过激活 Wnt 信号通路介导肾纤维化

该图通过转录组分析、通路验证及信号通路回补实验，证实 IQGAP1 通过激活 Wnt/β-catenin 信号通路，介导肾小管上皮细胞纤维化和 EMT，DCL 可通过靶向 IQGAP1 抑制该通路激活。A、B 图 IQGAP1 敲低细胞转录组火山图和 KEGG 富集分析显示，Wnt 信号通路是 IQGAP1 调控的最显著差异通路，提示 IQGAP1 核心调控 Wnt 通路；C、D 图 Western blot 和 qRT-PCR 结果显示，TGF-β1 诱导可激活 HK-2 细胞 Wnt 通路关键分子（CTNNB1、CCND1、MYC），DCL 处理可剂量依赖性抑制该激活；E、F 图 IQGAP1 敲低实验显示，沉默 IQGAP1 可直接抑制 TGF-β1 诱导的 Wnt 通路激活，与 DCL 作用效果一致；G、H 图 IQGAP1 过表达实验显示，过表达 IQGAP1 会进一步增强 TGF-β1 对 Wnt 通路的激活作用；I、J 图 Wnt 通路激动剂回补实验显示，Wnt 通路激动剂可逆转 IQGAP1 敲低对 EMT 和纤维化的抑制效果，证实 IQGAP1 介导肾纤维化的机制依赖于 Wnt 信号通路激活。

Figure 9：DCL 阻断 IQGAP1 与 CCT3 的相互作用进而抑制 Wnt 信号通路

该图通过互作蛋白筛选、互作验证及功能实验，揭示 DCL 抗肾纤维化的分子机制：DCL 结合 IQGAP1 后，阻断 IQGAP1 与伴侣蛋白 CCT3 的相互作用，进而抑制 Wnt 信号通路异常激活。A 图为 IQGAP1 互作蛋白筛选流程，通过免疫共沉淀联合质谱分析，筛选 DCL 处理后 IQGAP1 的互作蛋白；B 图互作蛋白丰度分析显示，CCT3 是 TGF-β1 诱导下与 IQGAP1 互作增强、DCL 处理后互作减弱的关键蛋白；C 图 SPR 实验证实 IQGAP1 与 CCT3 具有高亲和力；D 图原位邻位连接实验（PLA）显示，IQGAP1 与 CCT3 在 HK-2 细胞内存在直接相互作用，DCL 处理可显著减弱该相互作用；E、F 图免疫共沉淀实验进一步验证，TGF-β1 诱导增强 IQGAP1 与 CCT3 的结合，DCL 可阻断二者结合；G 图突变实验显示，IQGAP1 的 Cys1534 突变后，DCL 无法阻断 IQGAP1 与 CCT3 的结合，证实 DCL 阻断互作依赖于与 IQGAP1 Cys1534 的结合；H-J、K-L 图 CCT3 敲低实验显示，沉默 CCT3 可抑制 TGF-β1 诱导的纤维化、EMT 及 Wnt 通路激活，与 DCL 作用效果一致；M-O、P-Q 图回补实验显示，CCT3 敲低可逆转 IQGAP1 过表达诱导的纤维化和 Wnt 通路激活，证实 IQGAP1 通过 CCT3 调控 Wnt 通路，DCL 通过阻断二者互作发挥抗纤维化作用。

Figure 10：肾小管上皮细胞特异性敲低 IQGAP1 或 CCT3 可抑制小鼠肾纤维化

该图通过肾小管上皮细胞特异性基因敲低小鼠模型，在体内验证 IQGAP1-CCT3-Wnt 信号轴是肾纤维化的关键治疗靶点，为 DCL 的临床转化提供体内基因水平证据。A 图为肾小管上皮细胞特异性 IQGAP1 敲低模型构建及给药方案，通过肾皮质原位注射靶向肾小管上皮细胞的 AAV9 病毒，实现 IQGAP1 特异性敲低，再构建 UUO 模型并给予 DCL 处理；B、C 图验证敲低效果，AAV9-IQGAP1 病毒可显著降低小鼠肾组织 IQGAP1 mRNA 和蛋白表达；D 图 HE 和 Masson 染色显示，IQGAP1 特异性敲低可显著减轻 UUO 诱导的肾小管扩张、胶原沉积等病理损伤；E-H 图蛋白、基因检测结果显示，IQGAP1 敲低可抑制 EMT、纤维化、炎症相关因子表达，同时抑制 Wnt 通路激活；I 图为肾小管上皮细胞特异性 CCT3 敲低模型构建及给药方案，实验设计与 IQGAP1 敲低模型一致；J、K 图验证敲低效果，AAV9-CCT3 病毒可特异性降低肾组织 CCT3 表达；L-P 图染色、蛋白及基因检测结果显示，CCT3 特异性敲低同样可显著缓解 UUO 诱导的肾纤维化、EMT 及 Wnt 通路激活，与 IQGAP1 敲低效果一致，从体内层面证实 IQGAP1-CCT3-Wnt 信号轴是肾纤维化的核心调控轴，靶向该轴可有效治疗肾纤维化。

研究结论

本研究成功构建多模态 AI 中药症状预测模型 TCM-SPred，高效筛选出抗肾纤维化中药木香，明确其主要活性成分 DCL 具有显著体内外抗肾纤维化活性。机制上，DCL 通过共价结合 IQGAP1 的 Cys1534 位点，阻断 IQGAP1 与 CCT3 的相互作用，进而抑制 Wnt/β-catenin 信号通路异常激活，逆转肾小管上皮细胞 EMT，减少细胞外基质沉积，缓解肾纤维化。研究证实 IQGAP1-CCT3-Wnt 轴是肾纤维化治疗的关键靶点，DCL 具备成为肾纤维化精准治疗候选药物的潜力，为中药现代化与肾纤维化治疗提供新策略。

局限性：仅验证 IQGAP1 为核心靶点，未探究 DCL 其他潜在互作蛋白功能；未解析 DCL-IQGAP1 复合物晶体结构；动物实验为短期干预，缺乏长期药效及安全性数据。展望：后续将解析蛋白复合物结构，开展 DCL 长期体内安全性评价，推进 DCL 制剂开发及临床前研究，探索其联合用药潜力。