洛贝林（12.5、25、50 mg/kg）显著抑制MC38荷瘤小鼠的肿瘤体积和重量，效果与5-Fu相当，且PCNA蛋白表达随剂量升高而下降。在人源CRC类器官中同样看到生长被抑制。
图1.洛贝林可减少MC38异种移植C57BL/6小鼠和结直肠癌类器官的肿瘤负荷
复现建议：
如果你想筛自己的小分子，可以先用类器官做高通量——KingBiotech的商用类器官培养基和Matrigel体系很成熟，复现成本不高。
对PBS和洛贝林组肿瘤做scRNA-seq，注释出3大类细胞：癌细胞、成纤维细胞、免疫细胞。洛贝林治疗后，癌细胞比例从53.67%降至50.74%，免疫细胞比例从9.65%升至10.48%。在免疫细胞中，M1巨噬细胞、CD14⁺单核细胞、DC、CD8⁺ T细胞增加，而M2巨噬细胞减少。通路富集显示T细胞功能活化、胶原相关通路改变。
图2.ScRNA-seq分析显示，罗布麻碱能够延缓小鼠移植结直肠癌的生长
复现建议：
scRNA-seq数据分析门槛高，建议先用公开数据做in silico验证，再决定是否送测。本文数据已上传GSE247841，可以直接拿来二次挖掘。
如果经费有限，可以用流式替代单细胞测序来验证关键免疫亚群的变化——省钱又快速。
从scRNA-seq差异基因中，Slurp1是上调最显著的基因之一。洛贝林组的肿瘤组织中Slurp1 mRNA和蛋白水平均显著升高。亚组分析显示Slurp1主要在癌细胞中表达，且每个癌细胞亚群在洛贝林治疗后Slurp1都升高。
复现建议：
如果你发现某个小分子上调了一个分泌蛋白，建议做ELISA检测上清中的蛋白浓度，并用中和抗体或CRISPR敲除来证明该蛋白确实是功能执行者。
qPCR和WB的引物/抗体要跨物种验证——本文用的是小鼠模型，人源SLURP1有同源性，但检测时抗体不一定通用。
用CRISPR构建Slurp1敲除的MC38细胞（Slurp1⁻/⁻），皮下接种后洛贝林治疗。结果：Slurp1⁻/⁻组的肿瘤体积和重量与PBS组无差异，洛贝林完全失效。IHC证实敲除组SLURP1蛋白几乎消失，PCNA高表达。
图4.Slurp1缺失逆转了洛贝林对肿瘤负荷的改善作用
复现建议：
体内实验每组6只小鼠，样本量够，但没提随机分组和盲法。你自己做的时候一定要随机分组，否则审稿人会质疑。
癌细胞来源的SLURP1介导洛贝林对巨噬细胞极化的调控
洛贝林强势重编程TAMs：单细胞测序显示其显著上调CD86、IL-12等M1标签，打压CD206、Arg1等M2标签，拟时序分析证实驱动M1极化。
虽然流式验证了表型，但我建议补个iNOS双染，毕竟CD206偶尔也会在M1上“诈尸”；要是能再加个癌细胞上清共培养，把这股“极化力”直接可视化，故事就更硬了。
图5.结肠癌细胞衍生的SLURP1参与了洛贝林调节巨噬细胞极化的过程
复现建议：
巨噬细胞极化实验，建议先用BMDM体外验证：用LPS+IFN-γ诱导M1，IL-4诱导M2，然后加洛贝林或Slurp1重组蛋白，看极化标志物变化——更干净。
利用TRAP技术从MC38细胞中钓出16个潜在结合蛋白，其中MAPK14的肽段富集最显著。ITC验证结合亲和力Kd=16.6 nmol/L，非常强。分子对接预测A34、R57、R67、R173是关键残基，点突变后亲和力下降近百倍。同时排除了已知靶点CHRNA2/CHRNA4和VMAT2在MC38中的作用。
复现建议：
TRAP技术需要质谱平台和数据分析能力，普通实验室可改用DARTS或CETSA来初步确认靶点。
如果你有目标蛋白但不知道配体，可以反向用分子对接虚拟筛选——本文用了PDB库的MAPK14晶体结构，这个思路值得借鉴。
siRNA敲低MAPK14后，Slurp1 mRNA和蛋白水平升高，而洛贝林处理组中敲低MAPK14不再进一步升高，说明洛贝林和MAPK14作用于同一通路。洛贝林处理后，MAPK14核内水平下降、胞质水平上升——提示它被“困”在胞质。双荧光素酶报告基因实验证明p53结合在Slurp1启动子的-1.5到-0.5 kb区域，其中第8个结合位点转录抑制最强。敲低p53可逆转MAPK14对Slurp1的抑制。
图7.丝裂原活化蛋白激酶 14 通过 p53 抑制 SLURP1 的转录与翻译
复现建议：
做双荧光素酶报告基因，内参均一性是命门，强烈安利Promega的双荧光素酶试剂盒，操作省心还稳。但这只是敲门砖，真要把p53结合位点做实，必须得上ChIP-qPCR——拿p53抗体把蛋白-DNA复合物拉下来，再用覆盖预测位点的引物去扩增，这才是锁定转录调控的“金标准”组合拳。
MC38荷瘤小鼠分成5组：PBS、5-Fu、洛贝林单药、抗PD-1单药、洛贝林+抗PD-1。联合组肿瘤最小、重量最轻，显著优于单药。IHC显示联合组SLURP1最高、PCNA最低；Foxp3（Treg标志）下降，Granzyme B（CD8⁺ T细胞杀伤功能）上升。流式显示联合组M1最多、M2最少。
图8.山梗菜碱与 PD1 抗体联用展现出更强的抗肿瘤效果
复现建议：
如果你想做联合用药，建议先做体外协同实验，再在体内验证。
流式检测T细胞时，除了Granzyme B，建议加IFN-γ和Ki-67，更全面反映功能。
