IF14.1!南京中医药大学校长程海波用 “国自然+单细胞”荣登《AS》,逆转免疫抑制!

引言

结直肠癌的免疫治疗一直不太顺，问题主要出在肿瘤微环境里。那些M2型肿瘤相关巨噬细胞太多了，它们不光自己捣乱，还把PD-1抗体的疗效给拖垮了。怎么把这些M2型巨噬细胞掰成抗癌的M1型，是眼下研究的焦点。可惜的是，能实现这个目标的药物还很少，临床上急需新思路。

研究团队先用单细胞测序扫了一遍肿瘤里的细胞变化，发现lobeline处理后Slurp1明显升高。然后用TRAP技术揪出了lobeline的直接靶点MAPK14。接着做了Slurp1基因敲除，证实没有Slurp1的话lobeline就没效果。最后还用流式细胞术和小鼠模型验证了巨噬细胞极化和联合用药的效果。

研究者给荷瘤小鼠不同剂量的lobeline，发现图1显示肿瘤体积和重量呈剂量依赖性下降，25mg/kg效果最好。PCNA降低证实癌细胞增殖被抑制，人结直肠癌类器官也验证了效果。客观说，目前还只在皮下移植瘤模型验证，跟临床真实情况有差距，但体内外证据互相支撑，药效这块没问题（图1）。

图1 山梗菜碱抑制小鼠肠癌及类器官生长

思路复现：

先在小鼠身上打肿瘤，给不同剂量的药，看肿瘤长不长得动。 值得学习的是，他们不光用了MC38和CT26两种模型，还补了人结直肠癌类器官实验，这在药效验证里属于多维度交叉验证，避免了单一模型的偶然性。剂量依赖性和PCNA数据也让结论更有说服力。

单细胞测序显示lobeline让肿瘤里免疫细胞比例上升。 抗肿瘤的M1巨噬和CD8+T细胞都增加了，而帮肿瘤的M2巨噬减少了。 这说明lobeline能掰动巨噬细胞极化。 坦白讲数据来自皮下移植瘤，跟真实患者微环境有差距，但多亚群变化趋势清晰，免疫调节作用站得住（图2）。

图2 山梗菜碱抑制肠癌移植瘤生长

思路复现：

第二个结果想搞清楚lobeline对肿瘤微环境动了什么手脚。思路清晰，取两组小鼠肿瘤做单细胞测序，先分三大类细胞，再看免疫亚群变化。 值得学习的是，他们不光看比例，还做了通路富集和拟时序分析，把M1/M2极化方向推出来了。这种方法把细胞变化和功能走向串起来了，比单纯数细胞数高明。

lobeline处理后Slurp1表达明显上调。图3的免疫组化最直观，棕褐色越深代表蛋白越多，lobeline组明显比对照组深，说明转录和翻译两个层面都被促进了。 坦白讲这些数据来自皮下移植瘤模型，跟真实患者微环境有差距，但多方法交叉验证让结论很扎实，Slurp1作为关键响应分子的身份基本坐实（图3）。

 图3 山梗菜碱可促进SLURP1基因的转录与翻译

思路复现：

先靠单细胞测序筛出Slurp1这个差异最大的基因，然后用qPCR验证mRNA、Western blot验证蛋白、免疫组化看组织定位，一层层做实。 值得学习的是这种从组学发现到经典验证的闭环思路，不光筛得快，还拿金标准技术反复确认，避免了单一方法的假阳性风险。多技术交叉验证是最值得参考的点。

lobeline对野生型肿瘤有效，但Slurp1敲除后效果消失。图4曲线最说明问题：野生型+lobeline组最平缓，而Slurp1-/-+lobeline组跟没给药的敲除组几乎重合，说明没有Slurp1则lobeline无效。 坦白讲模型是皮下移植瘤，与临床有差距，但因果证据很硬，Slurp1是关键下游分子（图4）。

图4 敲除Slurp1使山梗菜碱失效

思路复现：

用CRISPR/Cas9把Slurp1敲掉，然后给lobeline，看肿瘤还长不长。结果敲除后药效没了，说明Slurp1必不可少。 值得学习的是遗传学验证逻辑：先看相关性（lobeline上调Slurp1），再做功能丧失实验（敲除后药效消失），把相关变因果，这套思路在机制研究里非常硬核。