南京工业大学材料化学工程国家重点实验室胡燚/年彬彬团队Bioresource Technology重要成果

• 生物催化因其高活性、高选择性和环境友好等优势，已成为绿色化学和可持续制造的重要核心技术。然而，在传统水相体系中，许多疏水底物溶解度较低，限制了反应效率；非水介质虽然能够改善底物传质并推动合成反应平衡，却会显著削弱天然酶的稳定性。对于脂肪酶而言，如何在有机溶剂等极端体系中同时维持高活性和高稳定性，仍是限制其工业应用的重要瓶颈。

• 针对这一问题，本研究以褶皱假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase, CRL）为模型酶，构建了一种整合祖先序列重构、自由能优化和表面水合层调控的三重协同进化策略。该策略首先通过祖先序列重构挖掘潜在有益位点，再利用自由能优化筛选更稳定的蛋白骨架，最后通过表面水合层调控强化酶分子在非水介质中的必要水合环境，从而构建“小而精”的组合突变文库。最优突变体 CM5（L15R/S45T/K85P/K231R）在 65%（v/v）DMSO 中的溶剂耐受性达到野生型的 4.78 倍，酶活性提高至野生型的 2.30 倍；固定化酶 CM5@AOMR 在深共熔溶剂体系中用于维生素 E 琥珀酸酯（VES）合成时，仅需 4 h 即可实现 99.9% 的产率，并且在连续 10 批次反应后仍保持 98.2% 的产率。本研究实现了从计算设计、突变体构建、发酵放大、固定化制备到功能性脂质实际生产的完整链条验证，为开发适应极端工业环境的下一代高性能生物催化剂提供了新的思路。

• 提出了一种整合祖先序列重构、自由能优化和表面水合层调控的三重协同进化策略，成功突破了脂肪酶在非水介质中的活性-稳定性权衡。

• 最优突变体 CM5 在 65% DMSO 中的溶剂耐受性是野生型的 4.78 倍，酶活性是野生型的 2.30 倍，并在乙腈、丙酮、甲醇、乙醇和异丙醇等多种常用有机溶剂中表现出显著提升的广谱耐受性。

• 分子动力学模拟表明，CM5 稳定性的增强源于蛋白骨架刚性的提高和表面水合层的稳定；其活性提升则与盖子结构域开盖能垒降低、底物通道优化及适宜的酶-底物亲和力密切相关。

• 固定化酶 CM5@AOMR 在深共熔溶剂体系中实现了维生素 E 琥珀酸酯的高效合成，4 h 产率达到 >99.9%，连续 10 批次反应后产率仍保持 98.2%。

图形摘要

图1 不同蛋白质工程策略设计的 CRL 突变体的溶剂耐受性与活性。（A-B）祖先序列重构策略获得的单突变体和双突变体；（C）自由能优化策略获得的单点饱和突变；（D）CRL 表面赖氨酸残基分布；（E-F）水合层调控策略获得的单突变体和双突变体；（G-H）祖先序列重构与自由能优化组合策略获得的双突变体和三突变体。结果表明，单一策略难以同步提升活性与稳定性。

图2 WT 与突变体的酶学性能。（A）组合突变体的活性与溶剂耐受性，其中 CM5（L15R/S45T/K85P/K231R）综合性能最佳；（B）WT 和 CM5 在 65% DMSO（v/v）中的半衰期对比，CM5 为 WT 的 3.57 倍；（C）温度活性曲线，CM5 最适温度提高 5 ℃；（D）CM5 在常用有机溶剂中的耐受性显著优于 WT。

图3 三重协同进化策略流程图。该策略以祖先序列重构挖掘适应性突变，以自由能优化筛选刚性蛋白骨架，并进一步结合表面水合层调控强化酶-水相互作用，从而构建高命中率的组合突变文库。

图4 WT 与 CM5 的结构及相互作用分析。（A）WT 和 CM5 的 RMSF 曲线；（B）WT 与 CM5 之间盖子结构域 α-螺旋（区域1）的结构比较；（C）WT 和 CM5 中盐桥相互作用（D392-K437）的分析。结果表明，CM5 的蛋白骨架刚性显著高于 WT。

图5 CRL 盖子结构域的构象转换机制。（A）CRL 盖子区域的打开和闭合构象视图；（B）CRL 盖子区域打开和闭合构象中的盐桥分析；（C）WT 和 CM5 的盖子区域构象转换自由能曲线。结果表明，CM5 的盖子区域构象转换能垒显著低于 WT。

图6 工程化脂肪酶 CM5 的放大制备与维生素 E 琥珀酸酯生物催化合成。通过 PDI 辅助表达、5 L 高密度发酵和 AOMR 固定化，CM5@AOMR 在 DES 体系中实现了 VES 的高效合成，并在连续批次反应中保持优异的重复使用性。

图7 VES的生物催化合成及固定化酶CM5@AOMR的重复使用性。（A）VES合成路线；（B）5 L发酵罐高密度发酵照片；（C）CM5@AOMR在DES体系中连续10批次反应后，VES产率仍维持在98%以上，表现出优异的操作稳定性。

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2026.135069

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