【结直肠癌类器官】揭秘免疫逃逸新机制!南京中医药大学团队用结直肠癌类器官解析PCSK9调控抗原呈递与血管屏障通路

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本图结合生物信息学分析与结直肠癌患者来源类器官（PDO） 实验，初步探究 PCSK9 的促癌作用。图 1A-D 利用多个肿瘤公共数据库分析，结果显示 PCSK9 在结直肠癌组织中表达显著高于正常组织，且该基因表达与肿瘤免疫通路密切相关；生存分析证实，PCSK9 高表达患者复发风险更高、总体预后更差。研究进一步构建 PCSK9 过表达类器官模型，体外功能实验结果直观体现：相比对照组，过表达组类器官体积更大、结构更致密（图 1F/K），细胞活力明显提升（图 1E）。Ki67 染色结果（图 1G/H）证明类器官增殖活性显著增强，Transwell 迁移实验（图 1I/J）也显示其迁移能力大幅提升。

本图围绕 PCSK9 与 MHC-I 家族关键蛋白 HLA-B 的相互作用展开验证，明确二者的结合关系与功能影响。图 2A 分子对接结果显示 PCSK9 与 HLA-B 结合能力极强，提示二者可形成稳定蛋白复合物。qPCR 与蛋白印迹实验（图 2B-D）发现，PCSK9 过表达会显著下调 HLA 的 mRNA 和蛋白水平，敲低 PCSK9 则使 HLA-B 表达回升。免疫荧光（图 2F-G）也观察到二者在细胞内共定位。环己酰亚胺追踪实验（图 2J）证实，PCSK9 会加速 HLA-B 蛋白降解；细胞热位移实验（图 2E）进一步证明 PCSK9 会降低 HLA-B 蛋白稳定性。免疫共沉淀（图 2K）直接验证两种蛋白在细胞内存在物理结合。功能回补实验（图 2H-I）显示，重新表达 HLA-B 可逆转 PCSK9 带来的促生长表型。

本图依托类器官与 T 细胞共培养体系，解析 PCSK9-HLA-B 轴对 T 细胞活化、增殖及杀伤功能的影响。实验设置阴性对照、PCSK9 敲低、HLA-B 敲低、双敲低四组。流式结果（图 3A-D）显示，单独敲低 PCSK9 可显著提升共培养体系中 CD3⁺CD8⁺T 细胞占比；而同时敲除 HLA-B 后，该改善效果被逆转。进一步检测 T 细胞活化标志物 CD69、CD25、CD71（图 3E-J），发现 PCSK9 敲低能有效解除 T 细胞耗竭，标志物表达上调，HLA-B 缺失则再次抑制 T 细胞活化。PD-1 检测（图 3K-L）也印证，PCSK9 敲低可降低 T 细胞表面耗竭分子。LDH 释放实验（图 3M）证明 T 细胞杀伤能力增强，ELISA、CFSE 实验（图 3N-Q）显示 IFN-γ、TNF-α 等效应因子分泌与 T 细胞增殖水平同步升高。

本图探究 PCSK9 通过免疫细胞因子，对血管内皮屏障的调控作用。实验采用内皮细胞与类器官共培养模型，重点检测内皮连接蛋白与屏障功能。VE-cadherin 免疫荧光及蛋白定量（图 4A-D）显示，PCSK9 敲低后内皮连接蛋白表达下降，细胞间连接松散；TEER 电阻值降低、FITC 葡聚糖通透性上升（图 4E-F），代表血管屏障通透性增加。而敲除 HLA-B 后，上述变化被逆转，血管屏障恢复完整性。研究同时检测紧密连接蛋白 ZO-1、Claudin-5，以及黏附分子 ICAM-1、VCAM-1（图 4G-K），PCSK9 敲低会下调屏障相关蛋白、上调黏附分子，利于免疫细胞跨血管迁移。

本图构建结直肠癌肝转移小鼠模型，在体内验证 PCSK9 干预联合 PD-L1 抑制剂的抗肿瘤作用。实验分为空白对照、单纯敲低 PCSK9、PCSK9 敲低 + PD-L1 抗体联合三组。从肝脏大体标本及转移结节统计（图 5A-B）可见，单独抑制 PCSK9 可明显减少转移灶，联合治疗组抑瘤、抗转移效果最为突出。血清因子检测（图 5C-D）显示，联合组 IFN-γ、TNF-α 浓度达到峰值。组织病理与免疫组化结果（图 5E-I）表明，PCSK9 敲低可降低肿瘤细胞增殖指数（Ki67），提升瘤内 CD3⁺、CD8⁺T 细胞浸润数量，联合用药效果进一步增强。血管相关指标检测（图 5J-P）发现，治疗后微血管密度、VE-cadherin 表达下降，血管结构发生重塑。扫描电镜（图 5Q）也直观呈现内皮细胞形态改变。