一区TOP| 南京中医药陆茵、韦忠红团队联合中国药科单云龙团队揭示黄芩汤恢复肠道菌群稳态以改善结肠炎

1.HQD改善实验性结肠炎中的炎症反应

分批制备HQD，并通过确认其主要成分化合物进行标准化（图1A）。为了探究HQD治疗作用的具体机制，本研究建立了2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的溃疡性UC小鼠模型。每日灌胃给予小鼠低剂量（HQD-L）、中剂量（HQD-M）或高剂量（HQD-H）的HQD，连续7天（图1B）。HQD治疗后，HQD-M和HQD-H组小鼠的体重显著恢复（图1C）。在造模期间，除对照组外，所有组均表现出显著的体重下降和疾病活动指数（DAI）的显著升高（图1D），基于曲线下面积（AUC）的剂量-反应分析进一步揭示了总体DAI和体重下降负担存在显著的剂量依赖性降低。处死后，收集结肠组织并测量其长度，结果表明HQD显著减轻了DSS诱导的结肠缩短（图1E-F）。此外，DSS模型组的脾脏和肝脏指数显著升高，但这些升高被HQD治疗逆转（图1G-H）。对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织病理学检查未发现明显异常，证实HQD给药未诱导急性全身毒性。苏木精-伊红（H&E）染色显示，HQD显著改善了DSS诱导的肠道损伤和炎症细胞浸润（图1L-M）。此外，酶联免疫吸附测定（ELISA）结果表明，HQD降低了升高的血清炎症因子水平，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）（图1I-K）。总之，HQD有效减轻了DSS诱导的小鼠肠道炎症。

图1.HQD改善实验性结肠炎的炎症反应。（A）负离子模式下采集的HQD提取物的总离子色谱图（TICs）。通过与标准品比对保留时间并验证实测m/z值来确认色谱峰：1芍药苷，2甘草苷，3甘草素，4异甘草苷，5黄芩苷，6黄芩素，7白杨素，8甘草酸。（B）DSS诱导结肠炎的实验设计和时间轴。（C）体重（每组n=10）。（D）DAI评分（每组n=10）。（E–F）结肠长度（每组n=10）。（G）脾脏指数（每组n=10）。（H）肝脏指数（每组n=10）。（I-K）血清GM-CSF、IL-1β和TNF-α水平（每组n=5）。（L）结肠组织的H&E染色。比例尺：800μm和50μm。（M）组织学评分（每组n=5）。数据以均值±SEM表示。多组间差异采用双因素方差分析（ANOVA）配合Tukey多重比较检验（C–D）以及单因素方差分析配合Dunnett T3多重比较检验（E-J，L）进行分析。^#P<0.05，^##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与DSS组比较。

2.HQD减轻中性粒细胞介导的结肠炎症

为了进一步探讨HQD在结肠炎中的抗炎作用，采用流式细胞术对结肠组织内的髓源性巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞以及CD4⁺辅助性T细胞进行了定量分析。HQD治疗显著减少了免疫细胞浸润，其中对中性粒细胞的作用最为显著（图2A-C）。免疫组化（IHC）进一步证实，HQD显著减轻了DSS诱导的中性粒细胞浸润（图2D-E）。

图2.HQD减轻中性粒细胞介导的结肠炎症。（A–C）巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺）、M-MDSCs（CD11b⁺Ly6C⁺）及PMN-MDSCs（CD11b⁺Ly6G⁺）的统计学分析（每组n=5）。（D）视野中Ly6G⁺区域百分比的统计学分析（每组n=3）。（E）结肠组织中Ly6G⁺的IHC染色。比例尺：50µm。（F）每组中CitH3免疫染色联合EUB338（红色）和DAPI（蓝色）荧光原位杂交（FISH）的细菌染色。比例尺：50µm和25µm。（G–H）结肠组织中CitH3⁺面积和细菌数量的统计学分析（每组n=3）。（I）中性粒细胞的分离。（J）使用不同HQD成分：黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、芍药苷、甘草苷、18β-甘草次酸（18β-GA）、甘草酸、甘草素和异甘草素，处理后中性粒细胞中的CitH3水平（每组n=3）。（K）未处理或经芍药苷、18β-GA或离子霉素处理的中性粒细胞的流式细胞术分析。（L）代表性的SYTOX绿色荧光染色。比例尺：50µm。数据以均值±SEM表示。多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。^#P<0.05，^##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与DSS组比较。

在UC中，中性粒细胞浸润和NETosis来源的中性粒细胞外陷阱（NETs）可通过释放蛋白酶和组蛋白来破坏细胞间连接，从而加剧上皮屏障损伤，进而促进细菌和内毒素易位并放大炎症级联反应。免疫荧光（IF）染色联合荧光原位杂交（FISH）进一步揭示，在DSS处理的小鼠结肠组织中存在短暂定植的微生物（图2F–H）。在DSS组中，观察到NETs标志物瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）与肠道细菌广泛共定位，而HQD处理后这种共定位显著减少（图2F-H）。此外，使用从小鼠骨髓分离的中性粒细胞来评估HQD成分的作用。结果表明，芍药苷和18β-甘草次酸有效抑制了NETosis（图2I-L）。总体而言，HQD有效抑制了免疫细胞募集和NETosis。

3.HQD在结肠炎恢复期促进肠道上皮再生和屏障修复

肠道干细胞（ISCs）是肠道稳态和损伤修复的核心，因其自我更新和多向分化能力使其能够在黏膜损伤后快速激活，以补充肠道上皮细胞（IECs）并修复UC中的溃疡屏障。鉴于ISC分化为对组织修复和稳态至关重要的黏膜细胞类型，采用IF染色检测位于肠隐窝底部的干细胞标志物。结果表明，DSS处理损害了Lgr5⁺干细胞，而HQD给药恢复了其增殖能力，且未诱导肠道上皮细胞的恶性增殖（图3A-B），PCR数据进一步支持了这一结果（图3C）。IF染色还显示，HQD拯救了被DSS损伤的Muc2⁺杯状细胞（图3D、F）。此外，肠道黏膜细胞的阿利新蓝染色显示，DSS处理后杯状细胞数量显著减少，而HQD给药逆转了这一效应（图3E、G）。另外，通过IF染色评估HQD对肠道屏障完整性的影响。HQD治疗通过增加紧密连接蛋白（包括ZO-1、E-cadherin和Claudin-1）的表达，显著增强了屏障功能（图3H-K）。此外，在观察到HQD对ISC的促再生作用的基础上，本研究探讨了微生物功能变化是否可能参与这一过程。综上所述，HQD通过促进ISC增殖来减轻结肠炎进展，从而恢复黏膜屏障和机械屏障的完整性。

图3. HQD在结肠炎恢复期促进肠道上皮再生和屏障修复。（A）Lgr5和Ki67的代表性IF图像。比例尺：25µm。（B）视野中每个隐窝内Lgr5⁺细胞数量的统计学分析（每组n=4）。（C）结肠中Lgr5的相对mRNA表达量（每组n=3）。（D）Muc2的代表性IF图像。比例尺：50µm。（E）阿利新蓝染色的代表性图像。比例尺：50µm。（F）Muc2⁺面积百分比的统计学分析（每组n=4）。（G）各组的阿利新蓝染色分析（每组n=3）。（H）E-cadherin（绿色）、Claudin-1（绿色）和ZO-1（红色）表达的代表性IF图像。比例尺：100μm。（I-K）视野中Claudin-1⁺面积、ZO-1+面积和E-cadherin⁺面积百分比的统计学分析（每组n=3）。数据以均值±SEM表示。多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。^#P<0.05，^##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与DSS组比较。

4.HQD在炎症条件下重塑与固有层相关的肠道微生物群

为确定HQD的治疗效果是否依赖于肠道微生物群，小鼠在DSS诱导结肠炎之前，用抗生素（ABX）预处理以清除共生菌（图4A）。ABX预处理显著减弱了HQD的疗效，表现为体重恢复减少以及DAI改善程度降低（图4B-C）。在微生物群耗竭后，HQD介导的对DSS诱导的结肠缩短和异常脾脏/肝脏指数的缓解作用也被削弱（图4D-G）。组织学观察发现，ABX预处理小鼠中HQD对黏膜损伤和炎症浸润的保护作用不如对照小鼠明显，与组织学评分结果一致（图4H–I）。总之，这些数据表明，完整的肠道微生物群是HQD在DSS诱导的结肠炎中发挥完全治疗益处所必需的。

图4.HQD重塑肠道微生物群。（A）DSS诱导结肠炎的实验设计及时间轴。（B）体重（每组n=5）。（C）DAI评分（每组n=5）。（D-E）结肠长度（每组n=5）。（F）脾脏指数（每组n=5）。（G）肝脏指数（每组n=5）。（H）结肠组织的H&E染色。比例尺：50μm。（I）组织学评分（每组n=5）。（J–K）维恩图展示三组之间在属水平（J）和种水平（K）共有物种的比较（每组n=5）。（L）α多样性（Chao1指数）（每组n=5）。（M）属水平主坐标分析（PCoA）图（每组n=5）。（N-O）门水平和属水平的组成（每组n=5）。（P）DSS组与HQD组之间差异丰度指示菌的LDA评分图（特征选择标准为对数LDA评分>3）（每组n=5）。

本研究接下来试图确定HQD是否调节定植于结肠组织的肠道微生物组。为此，进行了宏基因组测序，这是一种分析微生物群落基因组的高通量技术。维恩图展示了在属水平和种水平上，三组之间结肠固有层内微生物群组成的显著差异（图4J、K）。通过广义线性模型评估α多样性，揭示了DSS组与HQD组之间的差异（图4L）。使用主坐标分析（PCoA）在降维空间中可视化样本距离。散点图显示了三组之间不同的群落结构，突出了微生物组成的显著差异（图4M）。鉴于组成变化可能转化为与黏膜稳态相关的微生物功能的改变，接下来检查了微生物组的功能特征。HQD治疗重塑了肠道微生物群的功能结构，富集了参与碳水化合物和能量代谢的微生物基因。这种功能转变进一步提示了HQD驱动的微生物组重塑与上皮修复程序之间的潜在联系，因为在DSS诱导的结肠炎期间，能量相关微生物功能的变化可能与ISC相关再生的增强密切相关。

基于观察到的变化，接下来旨在鉴定参与HQD介导的肠道调节中的特定分类群和机制。在门水平上，优势分类群，包括芽孢杆菌门（Bacillota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、嗜热脱硫杆菌门（Thermodesulfobacteriota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、脱铁杆菌门（Deferribacterota）和假单胞菌门（Pseudomonadota），在各组中保持一致，尽管它们的相对丰度有所变化（图4N）。在属水平上，丰度最高的十个分类群包括Bacteria_unclassified、Lachnospiraceae_unclassified、Muribaculaceae_unclassified、Bacteroides、Akkermansia、Mucispirillum、Parabacteroides、Clostridium、Alistipes和Pseudoflavonifractor（图4O）。通过线性判别分析效应量（LEfSe）进行高维类别比较，揭示了DSS组和HQD治疗组之间优势细菌群落的显著差异（图4P）。分析确定Desulfovibrionaceae bacterium（来自Desulfovibrionia纲和Desulfovibrionaceae_unclassified属）是导致DSS组微生态失调的一个关键分类群。相比之下，Lachnospiraceae bacterium   A2（来自Clostridia纲和Lachnospiraceae_unclassified属）在HQD治疗组中显著富集，并可能有助于HQD在结肠炎中的治疗作用（图4P）。生成OTU气泡图和热图，以检查三组之间细菌丰度在种水平上的差异。值得注意的是，Lachnospiraceae A4和bacterium0.1×D8−71在DSS组中显著减少，而这些菌种在HQD组中富集。总体而言，HQD在炎症条件下有效调节结肠微生物群的组成。

5.Lachnospiraceae bacterium与Desulfovibrionaceae bacterium对肠道损伤和修复的相反作用

为了进一步研究肠道微生物群对结肠炎中ISC的影响，本研究建立了小鼠小肠类器官（图5A-B）。将Lachnospiraceae bacterium（L.B.）和Desulfovibrionaceae bacterium（D.V.）用于体外研究，并分别与类器官共培养24小时和48小时（图5C-D）。结果表明，活的D.V.对类器官具有直接的细胞毒性作用，损伤随时间推移而加剧（图5C）。相反，活的L.B.及其上清液显著促进了类器官生长，而热灭活的L.B.没有这种作用（图5D-F），在结肠类器官中得到类似结果。IF染色进一步证实了L.B.处理后类器官中Olfm4和β-catenin的上调（图5G）。用IWP-2进行药物性Wnt抑制显著抑制了类器官生长。此外，为了探索D.V.诱导的NETosis，从小鼠骨髓中分离中性粒细胞（图5H-J）。活的与热灭活的D.V.均能诱导NETs，而上清液的作用较弱。总之，HQD通过促进有益菌种的定植同时抑制致病菌种的定植，恢复了被DSS破坏的肠道微生物群。在机制上，HQD抑制D.V.诱导的NETosis和ISC损伤，同时增强L.B.介导的干细胞再生。

图5.HQD协调L.B.与D.V.的相反动态。（A）微生物群的共培养模型。（B）类器官以及类器官从第1天至第7天的生长状态变化。（C）与D.V.（每孔1×10⁴CFU）共培养24h和48h后，用光学显微镜观察类器官（n=3孔）。（D）在有或无L.B.、L.B.上清液及热灭活L.B.（每孔1×10⁴CFU）条件下培养24h和48h后类器官的代表性图像（n=3孔）。比例尺：50μm。（E–F）在有或无L.B.、L.B.上清液及热灭活L.B.处理48h后，类器官的大小和出芽数量（每个类器官n=6）。（G）Olfm4和β-catenin的代表性IF图像。比例尺：50µm。比例尺：500μm。（H）通过ELISA检测五组中CitH3的表达（n=3）。（I）经或未经D.V.及离子霉素处理的中性粒细胞的代表性流式细胞术分析。（J）代表性的SYTOX绿色荧光染色。比例尺：25µm。数据以均值±SEM表示。多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。^#P<0.05，^##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。

6.L.B.通过促进ISC增殖减轻结肠炎

基于L.B.增强类器官干性这一观察，本研究假设L.B.可能通过促进ISC增殖在体内减轻结肠炎。为了验证这一假设，对2.5% DSS诱导的UC小鼠每隔一天灌胃给予L.B.（1×10⁸CFU）（图6A）。与模型组相比，L.B.组小鼠的体重显著恢复，并且在DSS处理后显著升高的DAI评分明显降低（图6B-C）。L.B.显著恢复了结肠长度并降低了脾脏指数，但不影响肝脏指数（图6D-G）。H&E和阿利新蓝染色显示，L.B.改善了DSS诱导的肠道损伤并恢复了黏液细胞表达（图6H-J）。此外，L.B.降低了血清中GM-CSF、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

图6.L.B.通过促进ISC增殖减轻结肠炎。（A）DSS诱导结肠炎的实验设计及时间轴。（B）体重变化（每组n=10）。（C）DAI评分（每组n=10）。（D-E）结肠长度（每组n=10）。（F）脾脏指数（每组n=10）。（G）肝脏指数（每组n=10）。（H）H&E染色和阿利新蓝染色。比例尺：800μm和50μm。（I）组织学评分（每组n=4）。（J）各组的阿利新蓝分析（每组n=4）。（K）Lgr5、Ki67和Muc2的代表性IF图像。比例尺：10µm和20µm。（L）视野中每个隐窝内Lgr5⁺细胞数量的统计学分析（每组n=3）。（M）Muc2⁺面积百分比的统计学分析（每组n=3）。（N）β-catenin的代表性IF图像。比例尺：20μm。（O）Wnt信号通路示意图。（P–R）Wnt3a和β-catenin的蛋白质印迹结果及统计学分析。数据以均值±SEM表示。多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析（J-N）。^#P<0.05，^##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与DSS组比较。

为了阐明修复机制，本研究对Lgr5⁺ISC和Muc2⁺杯状细胞进行了IF染色。L.B.显著恢复了隐窝底部的ISC增殖，且未诱导IEC的异常增殖（图6K-M）。同时，结肠中β-catenin表达增加（图6N），提示Wnt/β-catenin信号通路被激活，该通路对ISC的维持和增殖至关重要（图6O）。为了证实Wnt通路激活的发现，蛋白质印迹分析显示，在L.B.处理的结肠中Wnt3a和β-catenin增加（图6P–R）。此外，流式细胞术分析显示，L.B.减少了巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和Th17细胞的募集，同时增加了产生IL-22的CD4⁺T细胞的数量。L.B.处理后肠道组织中的IL-22水平也显著升高。总之，这些发现表明，HQD至少部分通过调节益生菌L.B.来促进ISC增殖和上皮修复，L.B.通过依赖于Wnt/β-catenin的ISC介导的再生来减轻结肠炎。

HQD长期以来以其清肠止痢、调中止痛的传统功效而闻名，并仍临床用于湿热泻痢、痢疾和UC。以往关于HQD及其主要成分（特别是黄芩）的研究主要集中在其直接的抗炎和抗氧化作用，而对特定微生物介导物及其下游机制的鉴定仍然有限。越来越多的多组学证据表明，肠道微生态失调不仅仅是UC中的旁观者，而是一个关键促成因素，可以塑造炎症微环境和黏膜愈合能力。本研究发现HQD通过调节两个关键功能分类群（D.V.和L.B.）来减轻结肠炎，这两个分类群分别对炎症组织损伤和上皮修复产生不同作用。本研究为中药复方HQD通过肠道微生物群发挥治疗作用的机制提供了新的视角，并强调了D.V.和L.B.的相互调节作为中医内在阴阳平衡原则的微生物体现。

鉴于肠道微生物群在UC中的重要作用，本研究首先使用抗生素耗竭来表明HQD的治疗效果在很大程度上依赖于微生物群。D.V.和L.B.成为关键分类群，在多个分类水平（从纲到属）始终被确定为最具判别力的分类群。D.V.是一种有鞭毛的、厌氧的、硫酸盐还原菌，在UC患者的粪便样本中富集，本研究的数据进一步支持其作为一种潜在的致病共生菌。本研究发现D.V.直接损伤肠道上皮，破坏屏障完整性并加剧结肠炎，这与报道称普通脱硫弧菌鞭毛蛋白破坏上皮细胞和紧密连接、促进细菌易位并驱动炎症相一致，提示鞭毛蛋白样毒力因子参与了观察到的屏障损伤。相比之下，本研究将L.B.鉴定为有助于HQD疗效的候选有益共生菌，此前关于Lachnospiraceae成员在结肠炎和结直肠癌中保护作用的证据支持了这一观点。值得注意的是，生物活性微生物代谢产物如短链脂肪酸（SCFAs）可能是L.B.通过Wnt信号激活诱导肠道保护的关键介导物。这一方面值得在未来的研究中进一步探讨。

在本研究中，HQD治疗显著减轻了免疫细胞，特别是中性粒细胞的浸润。肠道微生态失调，特别是疾病相关分类群的过度生长，可以促进中性粒细胞募集并触发NETosis。越来越多的证据表明，过量的NETs可以直接损伤黏膜并破坏上皮屏障完整性，从而加剧炎症。与这些发现一致，本研究结果提供了功能性证据，表明在DSS诱导的结肠炎中显著富集的D.V.是NETosis的关键微生物驱动因素。HQD似乎通过两种互补机制抑制NETosis：通过抑制D.V.扩增以减少微生物刺激，以及通过代表性成分如芍药苷和18β-甘草次酸直接抑制NET形成。即便如此，HQD成分的相对效能、其剂量反应关系以及所涉及的特定细胞内通路仍需进一步阐明。

肠道上皮修复是HQD在结肠炎中发挥治疗作用的另一个关键机制。ISC是损伤后上皮修复的核心，受经典通路调节，其中Wnt/β-catenin作为关键的再生轴。虽然以往关于HQD的研究主要集中在其成分对宿主的直接作用上，但其修复功能似乎涉及微生物介导的ISC活性调节。特别是，结合ABX耗竭结果和对HQD响应分类群的功能验证，本研究发现支持HQD通过一种有益微生物（L.B.）促进上皮再生，从而将HQD驱动的微生物重塑与UC中干细胞驱动的黏膜愈合联系起来。