南京农大蒋明义团队一区TOP期刊盐胁迫成果:水稻MAP4K家族基因通过磷酸化激活OsMKK6正向调控耐盐性的全新分子通路

中文摘要

高盐胁迫严重抑制植物生长发育，导致水稻产量显著下降。尽管植物MAP4K在胁迫响应中的功能研究已取得重要进展，但水稻MAP4K在非生物胁迫（特别是耐盐性）中的作用仍然未知。本研究发现OsMAP4K6是水稻盐胁迫耐受性的正调控因子，这一功能在单子叶植物的该基因家族中尚未见报道。我们证明OsMAP4K6在盐胁迫下调控根部Na⁺流并维持Na⁺/K⁺稳态。此外，我们发现了一种独特的调控机制：OsMAP4K6直接与OsMKK6相互作用并磷酸化其Ser13位点，该位点的磷酸化对于盐胁迫下增强OsMKK6的激活至关重要。遗传学证据表明，OsMKK6和OsMAP4K6在水稻耐盐性中发挥相似作用。我们的研究不仅确立了OsMAP4K6作为水稻耐盐性的关键因子，还揭示了一条连接MAP4K与MAPK级联组分的全新直接调控通路，为植物适应盐胁迫提供了新的机制见解。

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利用基于旭月非损伤微测技术（NMT）的旭月耐盐机制分析仪，检测盐胁迫下水稻根际Na⁺和K⁺转运速率，结果显示120 mmol L^-1NaCl处理显著增加了野生型水稻根部的Na⁺外排。在OsMAP4K6过表达株系中，Na⁺外排能力进一步增强，同时根部表现出净K⁺内流；而在osmap4k6敲除突变体中，Na⁺外排显著减少，且根部呈现明显的K⁺外泄。OsMAP4K6过表达株系通过增强Na⁺外排和促进K⁺吸收，维持了根尖离子稳态；敲除株系则因Na⁺外排能力降低和K⁺大量流失，加剧了盐胁迫下的离子失衡。

图1 盐胁迫下水稻根际Na⁺、K⁺转运速率检测。流速值的正负号仅代表离子/分子转运方向，正值表示从根内排出到根外，负值表示从根外流入到根内

在无盐条件下，野生型、OsMKK6过表达株系与osmkk6敲除突变体根部的Na⁺和K⁺转运速率均无显著差异。经120 mmol L⁻¹NaCl处理后，野生型水稻根部表现出明显的Na⁺外排和K⁺外泄；OsMKK6过表达株系的Na⁺外排能力显著增强，同时根部由K⁺外泄转为微弱的K⁺内流；而osmkk6敲除突变体的Na⁺外排显著减少，且K⁺外泄程度较野生型更为严重。OsMKK6过表达株系通过促进Na⁺外排和抑制K⁺流失维持了根尖离子稳态；敲除株系则因Na⁺外排能力下降和K⁺大量外泄，导致更多的盐离子在根中积累，加剧了盐胁迫损伤。

图2 盐胁迫下水稻根际Na⁺、K⁺转运速率检测。流速值的正负号仅代表离子/分子转运方向，正值表示从根内排出到根外，负值表示从根外流入到根内

同领域成果报告分享：中国农业大学郭岩团队盐胁迫研究报告回放

与NMT数据相关性较高的其他实验结果

1、OsMAP4K6调控盐胁迫下水稻Na⁺/K⁺稳态的离子积累分析

在正常生长条件下，野生型、OsMAP4K6过表达株系与osmap4k6敲除突变体之间的Na⁺、K⁺含量及Na⁺/K⁺比值均无显著差异。经120 mmol L⁻¹NaCl处理2天后，所有株系的Na⁺含量均上升、K⁺含量均下降，但OsMAP4K6过表达株系地上部和根部的Na⁺积累显著低于野生型，而K⁺保留量显著高于野生型，因此Na⁺/K⁺比值最低；相反，osmap4k6敲除突变体表现出更高的Na⁺积累、更低的K⁺含量及最高的Na⁺/K⁺比值。OsMAP4K6的过表达通过降低Na⁺吸收并促进K⁺保留，维持了盐胁迫下植株体内的离子稳态；而敲除OsMAP4K6则导致Na⁺/K⁺平衡严重失调，加剧了盐胁迫对植株的伤害。

图3OsMAP4K6调控盐胁迫下水稻Na⁺/K⁺稳态的离子积累分析

2、OsMKK6调控盐胁迫下水稻Na⁺/K⁺稳态的离子积累分析

在正常生长条件下，野生型、OsMKK6过表达株系与osmkk6敲除突变体之间的Na⁺、K⁺含量及Na⁺/K⁺比值均无显著差异。经120 mmol L⁻¹NaCl处理2天后，所有株系的Na⁺含量均上升、K⁺含量均下降。与野生型相比，OsMKK6过表达株系地上部和根部的Na⁺积累显著降低，而K⁺保留量显著升高，因此Na⁺/K⁺比值最低；相反，osmkk6敲除突变体表现出更高的Na⁺积累、更低的K⁺含量及最高的Na⁺/K⁺比值。OsMKK6的过表达通过促进Na⁺外排和K⁺保留，维持了盐胁迫下植株体内的离子稳态；而敲除OsMKK6则导致Na⁺/K⁺平衡严重失调，Na⁺/K⁺比值显著升高，加剧了盐胁迫对植株的伤害。

图4过表达OsMKK6可增强水稻体内的Na⁺/K⁺稳态

其他实验结果

1、OsMAP4K6是水稻中一种功能保守的蛋白激酶

OsMAP4K6的CDS长2082 bp，编码693个氨基酸，属于Clade III-B亚家族，与拟南芥AtMAP4K4亲缘关系最近。其N端含有典型的激酶结构域（包括GxGxxG/A基序、ATP结合必需的保守Lys43、催化必需的Asp137及DFG基序），C端为调控结构域。体外激酶实验表明，重组GST-OsMAP4K6具有明显的自磷酸化活性，而激酶失活突变体GST-OsMAP4K6^K43A则完全丧失活性，证实OsMAP4K6是一个功能性激酶。亚细胞定位分析显示，OsMAP4K6-YFP融合蛋白主要定位于水稻原生质体的细胞质和质膜，与质膜染料FM4-64共定位，而与核染料DAPI无重叠。这些结果表明OsMAP4K6是一个具有典型激酶特征的膜关联蛋白激酶，为其在盐胁迫信号转导中的功能奠定了基础。

图5 OsMAP4K6是水稻中一种功能保守的蛋白激酶结果

2、OsMAP4K6正调控水稻盐胁迫耐受性的表型与生理分析

在正常条件下，野生型、过表达株系与敲除突变体之间无明显表型差异。经120 mmol L⁻¹NaCl处理7天并恢复8天后，OsMAP4K6过表达株系的叶片损伤较轻，存活率和叶绿素含量显著高于野生型，而敲除突变体的存活率和叶绿素含量则显著低于野生型。同时，过表达株系的丙二醛含量和电解质渗漏率增幅最小，敲除突变体的增幅最大。盐胁迫诱导OsMAP4K6转录水平在90分钟时升高约3.3倍，并显著增强其激酶活性。OsMAP4K6的过表达通过减轻氧化损伤和膜脂过氧化、维持较高的光合能力，从而增强水稻的耐盐性；而敲除OsMAP4K6则导致盐胁迫下氧化损伤加剧、膜透性增加，耐盐能力显著下降。

图6 OsMAP4K6正调控水稻盐胁迫耐受性的表型与生理分析结果

3、OsMAP4K6与OsMKK6蛋白相互作用的验证分析

采用pull-down、免疫共沉淀（Co-IP）及荧光素酶互补成像（LCI）技术，检测了OsMAP4K6与OsMKK6在体内外的相互作用。结果显示，pull-down实验证明OsMAP4K6与OsMKK6在体外特异性结合，而GST空蛋白对照无结合信号。Co-IP实验显示，在水稻原生质体中共表达Myc-OsMAP4K6和Flag-OsMKK6时，Myc-OsMAP4K6能够与Flag-OsMKK6共沉淀；单独表达任一蛋白的阴性对照无共沉淀信号。LCI实验进一步证实，共表达OsMAP4K6-nLUC与OsMKK6-cLUC的烟草叶片呈现明显的荧光信号，而阴性对照组无荧光。此外，盐胁迫处理可显著增强OsMAP4K6与OsMKK6在体内的相互作用。OsMAP4K6通过其N端结构域与OsMKK6的N端结构域相互作用。这些结果表明OsMAP4K6与OsMKK6在体内外均存在物理相互作用，且盐胁迫促进两者结合，为OsMAP4K6磷酸化调控OsMKK6提供了分子基础。

图7 OsMAP4K6与OsMKK6蛋白相互作用的验证分析结果

4、OsMAP4K6磷酸化OsMKK6 Ser13位点并增强其激酶活性的机制分析

采用体外激酶测定、LC-MS/MS质谱分析及免疫沉淀激酶实验，检测了OsMAP4K6对OsMKK6的磷酸化修饰及其功能影响。结果显示，体外激酶实验结合LC-MS/MS分析鉴定出OsMAP4K6直接磷酸化OsMKK6的Ser13位点；将Ser13突变为Ala（S13A）后磷酸化信号消失，而突变为Asp（S13D）的磷模拟突变体则表现出显著增强的自磷酸化及底物MBP磷酸化能力。在体内实验中，盐胁迫处理下，osmkk6敲除突变体原生质体中表达OsMKK6^S13A-GFP的激酶活性显著低于表达OsMKK6-GFP的对照，而OsMKK6^S13D-GFP则表现出更强的激酶活性。进一步免疫沉淀激酶实验显示，在OsMAP4K6过表达株系中盐胁迫诱导的OsMKK6激酶活性增强幅度最大，而在osmap4k6敲除突变体中该诱导效应被显著抑制。OsMAP4K6通过直接磷酸化OsMKK6的Ser13位点激活OsMKK6，该磷酸化修饰是盐胁迫下OsMKK6充分激活所必需的关键分子事件。

图8 OsMAP4K6磷酸化OsMKK6 Ser13位点并增强其激酶活性的机制分析

5、OsMKK6正调控水稻盐胁迫耐受性的表型与激酶活性分析

采用盐胁迫表型观察、存活率统计及免疫沉淀激酶活性测定技术，检测了OsMKK6过表达株系和敲除突变体在NaCl处理后的表型变化及OsMKK6的激酶活性。结果显示，在正常条件下，野生型、过表达株系与敲除突变体之间无明显表型差异。经120 mmol L⁻¹NaCl处理7天并恢复8天后，OsMKK6过表达株系的叶片损伤较轻，存活率和叶绿素含量显著高于野生型，而osmkk6敲除突变体的存活率和叶绿素含量则显著低于野生型。盐胁迫时间梯度处理结合免疫沉淀激酶实验表明，OsMKK6的激酶活性在NaCl处理后逐渐升高，在90–120分钟达到峰值。OsMKK6的过表达通过增强其激酶活性提高水稻耐盐性；而敲除OsMKK6则导致激酶活性丧失，盐胁迫下存活率显著下降。这些结果表明OsMKK6是水稻盐胁迫耐受性的正调控因子。

图9 OsMKK6正调控水稻盐胁迫耐受性的表型与激酶活性分析

结论

本研究首次报道了水稻中OsMAP4K6作为盐胁迫正调控因子的功能。通过CRISPR-Cas9敲除和过表达实验，证明OsMAP4K6能显著提高水稻在盐胁迫下的存活率、叶绿素含量，降低MDA和电解质渗漏率，并减轻氧化损伤。机制上，OsMAP4K6直接与OsMKK6相互作用，并磷酸化其Ser13位点，该磷酸化是盐胁迫下OsMKK6激活所必需的。遗传和生理数据表明，OsMAP4K6-OsMKK6模块通过促进根系Na⁺外排、抑制K⁺外泄，维持Na⁺/K⁺稳态，从而增强水稻耐盐性。值得注意的是，在Osmap4k6突变体中盐诱导的OsMKK6激活并未完全消失，提示还存在其他上游调控因子。本研究揭示了植物中首个MAP4K直接调控MAPKK的分子机制，为作物耐盐育种提供了新靶点。

检测离子/分子指标（NMT实验）

检测样品及具体位点（NMT实验）

水稻根分生区，即距离根尖2–3 mm处的根表上的点

测试液

Na⁺：0.1 mM CaCl₂，0.1 mM KCl，0.3 mM MES，0.5 mM NaCl，pH 6.0

K⁺：0.1 mM CaCl₂，0.1 mM KCl，0.3 mM MES，0.5 mM NaCl，pH 6.0

仪器信息

旭月耐盐机制分析仪

旭月植物养分高效机制分析仪

旭月重金属阻控机制分析仪

旭月Physiolyzer®（NMT活体生理检测仪®）

供稿人简介

彭银霞，沈阳农业大学园艺学院博士，主要从事光信号调控番茄耐盐机制的研究。