南京中医药大学/ 南京大学发现仙连解毒汤通过Plaur/Hbegf/EGFR轴抑制结直肠癌肝转移的新机制,成果发表于11.2分期刊Phytomedicine

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结直肠癌肝转移是晚期结直肠癌患者的主要死亡原因，现有治疗手段获益有限，亟待探索新的干预策略。仙连解毒汤是具有抗结直肠癌活性的临床经验中药复方，但其抗肝转移的分子靶点与作用机制尚未阐明。南京中医药大学江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心联合南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室在Phytomedicine发表最新研究，整合转录组、蛋白质组与单细胞多组学技术，结合体内外功能实验与生物物理验证，系统阐释了仙连解毒汤抑制结直肠癌肝转移的作用机制。研究证实 Plaur/Hbegf/EGFR 轴是仙连解毒汤的核心作用靶点，该复方可通过靶向 Plaur 阻断 Mmp9 介导的 Hbegf 释放，抑制 EGFR/ERK 信号活化与肌动蛋白细胞骨架重塑，同时重塑肿瘤微环境，减弱恶性细胞与肿瘤相关巨噬细胞的促转移通讯，并鉴定出环黄芪醇为直接结合 Plaur 的入肝活性成分，为仙连解毒汤的临床转化与抗转移应用提供了重要科学依据。

结直肠癌是全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤，远处转移是患者死亡的首要原因，其中肝脏是最常见的转移靶器官，结直肠癌肝转移仍是临床长期生存的主要障碍。当前手术切除、系统化疗与靶向治疗对晚期肝转移的获益有限，且易出现耐药与复发，肿瘤细胞内在侵袭特性与肝转移微环境的免疫抑制、促定植效应共同推动了转移进展，因此挖掘可同时干预肿瘤细胞侵袭与微环境的新靶点与治疗策略具有重要临床价值。中医药在肿瘤辅助治疗中展现出多靶点、多通路调控的优势，仙连解毒汤是基于中医 “癌毒” 理论创制的临床经验复方，前期研究已证实其可通过调控代谢模式、重塑肠道菌群抑制结直肠癌进展，网络药理学也提示其具有广泛的抗肿瘤调控活性，但该复方抑制结直肠癌肝转移的具体分子机制，尤其是在肌动蛋白骨架重塑、恶性细胞亚群状态转变与肿瘤微环境重编程层面的作用尚不明确。Plaur 编码的尿激酶型纤溶酶原激活物受体是调控肿瘤侵袭转移的关键膜分子，可通过调控细胞外基质重塑与 EGFR 相关信号促进转移表型，且与肌动蛋白骨架重塑密切相关，但其是否为仙连解毒汤的作用靶点尚未得到系统验证，明确这一问题可为复方的临床转化与抗转移应用提供核心理论支撑。

     本研究采用体内动物实验、体外细胞功能实验联合多组学技术的整合研究策略，从整体、细胞、分子与微环境多层面系统阐释仙连解毒汤抑制结直肠癌肝转移的作用机制与药效物质基础。研究首先通过脾内注射 CT26 结肠癌细胞构建小鼠结直肠癌肝转移模型，设置低 / 高剂量给药组与 5 - 氟尿嘧啶阳性对照组，从大体病理、组织形态与凋亡增殖指标层面验证复方的抗转移活性与安全性；其次对肝转移组织进行匹配的转录组与蛋白质组测序，通过差异分子交集筛选、通路富集与蛋白互作分析，锁定 Plaur/Hbegf 轴为核心候选靶点，并结合公共临床数据集验证靶点的临床相关性；进一步利用单细胞 RNA 测序技术，在单细胞分辨率下解析复方对恶性细胞异质性亚群、髓系细胞状态以及细胞间通讯网络的调控作用；随后通过基因敲低 / 过表达、划痕愈合、Transwell 侵袭、细胞骨架染色等体外实验，结合体内 Plaur 过表达回补实验，验证 Plaur 在转移进程与药物效应中的功能，并解析下游 EGFR/ERK - 细胞骨架调控通路；最后通过 UPLC-MS/MS 分析复方在体内吸收入血、入肝的化学成分，结合分子对接、SPR、MST 等生物物理技术筛选并验证直接结合 Plaur 的活性物质，明确复方的药效物质基础。

1.仙连解毒汤颗粒的化学谱分析与质量控制

采用超高效液相色谱 - 串联质谱（UPLC-MS/MS）对仙连解毒汤颗粒分别进行正、负离子模式下的全谱分析，共筛选并注释 40 个特征色谱峰，完成对应植物化学成分的鉴定与分类；本研究重点关注的 Plaur 结合成分环黄芪醇对应正离子模式下的 19 号特征峰。该结果建立了仙连解毒汤颗粒的化学表征方法，为后续实验提供了质量控制基础。

2.仙连解毒汤减轻 CT26 小鼠结直肠癌肝转移模型的转移负荷

通过脾内注射 CT26 结肠癌细胞构建小鼠结直肠癌肝转移模型，连续给药 3 周后，大体观察与定量分析显示仙连解毒汤呈剂量依赖性降低肝脏指数、减少肝表面可见转移结节数，高剂量组效应更显著；组织病理显示给药组肝内肿瘤浸润范围缩小、肝组织结构破坏减轻；免疫组化证实转移灶内凋亡信号增强；给药期间小鼠体重无明显下降，提示复方无显著体内毒性。

3.转录组 - 蛋白质组整合分析联合公共数据集验证 Plaur/Hbegf 轴为仙连解毒汤候选靶点

对肝转移组织进行转录组与蛋白质组测序，对下调的差异基因与差异蛋白取交集，筛选出 Hbegf 等核心共有分子，结合蛋白互作网络与表达相关性分析，锁定 Plaur/Hbegf 轴为核心候选靶点；体内验证显示仙连解毒汤可在 mRNA 与蛋白水平同步下调 Plaur 与 Hbegf 的表达。公共数据集分析证实，PLAUR 在人结直肠癌组织中表达高于正常组织，转移灶中表达进一步升高，且高表达与患者更差的总生存期显著相关。

4.单细胞测序揭示仙连解毒汤减少 Plaur 高表达恶性细胞亚群并促进干扰素反应状态

对肝转移组织进行单细胞 RNA 测序，解析出恶性上皮细胞的多个异质性亚群；差异丰度分析显示，仙连解毒汤可显著减少 Plaur 表达富集的 Car6⁺恶性细胞亚群，同时上调 Ifit1⁺干扰素反应型恶性细胞亚群的比例。拟时序分析提示药物推动恶性细胞向干扰素反应状态转变；单细胞通路与转录因子分析显示，给药后恶性细胞的代谢谱发生重编程，Stat1、Irf1、Irf7 等干扰素相关转录因子活性显著增强。

5.单细胞测序揭示仙连解毒汤重塑髓系细胞状态并减弱 Car6⁺恶性细胞与 Thbs1⁺巨噬细胞的通讯

解析肝转移微环境的髓系细胞亚群，鉴定出 Thbs1⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAM）促转移亚群；仙连解毒汤可显著减少该亚群的比例，推动髓系细胞偏离 Thbs1⁺促转移状态，向干扰素相关转录程序转变。细胞通讯分析显示，Car6⁺恶性细胞与 Thbs1⁺ TAM 之间的 Spp1-Cd44 配受体相互作用在给药后强度显著减弱。体外补充实验证实，肿瘤细胞过表达 Plaur 可上调 Spp1 的表达与分泌，并促进共培养巨噬细胞中 CD44、Arg1、Mrc1 等 M2 样极化分子的表达。

6.敲低 Plaur 抑制结直肠癌细胞迁移、侵袭与肌动蛋白细胞骨架重塑

9.环黄芪醇是仙连解毒汤中可到达靶组织、直接结合 Plaur 并抑制其表达的活性成分

通过 UPLC-MS/MS 在给药小鼠的血清与肝转移组织中鉴定出多种吸收入血、入肝的复方成分，以萜类与甾体类为主，来源于复方中的多味药材。其中环黄芪醇可在肝转移组织中被定量检测，平均组织浓度为 671.59 ng/g。分子对接预测环黄芪醇可稳定结合于 Plaur 的蛋白结合口袋，表面等离子体共振（SPR）与微量热泳动（MST）实验证实二者存在直接特异性结合，MST 测得解离常数 Kd 为 36.74 μM。细胞实验显示，环黄芪醇可浓度依赖性下调 CT26 细胞中 Plaur 的 mRNA 与蛋白表达。

10.仙连解毒汤抑制结直肠癌肝转移的 Plaur 中心信号机制示意图

该图为机制总结模式图：促转移状态下，结直肠癌细胞高表达 Plaur，通过上调 Mmp9 促进 Hbegf 的剪切脱落与释放，分泌型 Hbegf 结合并激活 EGFR，进一步磷酸化激活 ERK，通路上调 Fscn1、Cdc42ep1 等骨架效应分子，驱动肌动蛋白细胞骨架重塑与伪足形成，最终促进细胞侵袭与肝转移；仙连解毒汤及其活性成分环黄芪醇靶向抑制 Plaur，阻断该信号轴的级联活化，破坏细胞骨架重塑，最终抑制结直肠癌肝转移。

本研究从整体动物、细胞分子、肿瘤微环境与药效物质基础多维度，系统揭示了仙连解毒汤抑制结直肠癌肝转移的作用机制，明确 Plaur 是该复方的核心功能靶点，阐明了 “Plaur-Mmp9-Hbegf-EGFR/ERK - 肌动蛋白细胞骨架重塑” 的胞内调控通路，同时发现复方可通过调控恶性细胞亚群状态与肿瘤相关巨噬细胞功能，重塑肝转移微环境并减弱促转移细胞间通讯，还鉴定出环黄芪醇为可入肝、直接结合 Plaur 的活性成分，为仙连解毒汤的临床抗转移应用提供了扎实的实验依据与理论支撑，也为中药复方多靶点抗转移的机制研究提供了方法学参考。

但本研究仍存在一定局限性：其一，单细胞测序仅解析了细胞的转录状态与比例变化，未明确不同细胞亚群在转移灶内的空间分布，无法精准定位 Car6⁺恶性细胞与 Thbs1⁺巨噬细胞的空间互作位置；其二，机制验证主要基于 CT26 同基因小鼠模型，尚缺乏人源肿瘤组织、类器官或更多细胞系的交叉验证；其三，虽证实肿瘤细胞 Plaur 可调控 Spp1-Cd44 轴与巨噬细胞极化，但未通过配体中和或受体敲低实验明确该通路是否为复方微环境调控的必需环节；其四，未量化各吸收入肝成分对复方整体药效的贡献占比。后续可结合空间转录组、人源类器官与中和抗体实验进一步完善机制验证，并探索复方与免疫治疗的联合应用潜力。