南京医科大学氧化修饰新靶点:巨噬细胞 HINT1 的 S - 亚硝基化驱动泡沫细胞形成与动脉粥样硬化进展
- 2026-08-10 12:25:59
前言
研究先通过 LC-MS/MS 联合生物素置换筛选 ox-LDL 刺激巨噬细胞中发生 S - 亚硝基化的蛋白，锁定 HINT1 并鉴定修饰位点 Cys84，再分别利用人动脉粥样硬化斑块、高脂喂养 LDLR⁻/⁻小鼠主动脉验证 SNO-HINT1 在粥样硬化病灶中上调；细胞层面构建 HINT1 敲除巨噬细胞回补野生型 / 突变型 HINT1，结合油红 O、脂质摄取、胆固醇流出实验明确 SNO-HINT1 促泡沫细胞生成，继而分别解析胞质中 SNO-HINT1 结合 SR-A1 抑制溶酶体降解、细胞核中 HINT1 减少结合 USF2 上调 CD36 转录两条通路，借助核质分离、CRM1 抑制剂证实修饰后 HINT1 依赖 CRM1 出核，再通过 iNOS 抑制剂与 iNOS 敲除模型确认 iNOS 是催化 HINT1 亚硝基化的关键酶，最后采用骨髓移植联合巨噬细胞特异性 AAV 体内干预，证实阻断 HINT1 C84 亚硝基化可减轻小鼠动脉粥样硬化，完整阐明 iNOS-SNO-HINT1 核质重分布调控 SR-A1/CD36、促进泡沫细胞与动脉粥样硬化的分子轴，提出 SNO-HINT1 为动脉粥样硬化潜在治疗靶点。
研究要点解析
研究方法
首先利用无偏质谱筛选 ox-LDL 诱导巨噬细胞内 S - 亚硝基化蛋白，锁定 HINT1 并定位修饰位点 Cys84；在人粥样硬化组织、高脂动脉粥样硬化小鼠体内验证 SNO-HINT1 表达上调；构建 HINT1 敲除巨噬细胞，回补野生型与 C84A 突变体，明确 SNO-HINT1 对泡沫细胞形成、脂质摄取的调控作用；分胞质、细胞核两条分支解析下游通路：胞质层面探究其对 SR-A1 溶酶体降解的调控，细胞核层面探究其通过转录因子 USF2 调控 CD36 转录的机制；通过核质分离、CRM1 抑制剂明确 S - 亚硝基化介导 HINT1 核输出；使用 iNOS 抑制剂、iNOS 敲除细胞确认上游催化酶；最后通过骨髓移植 + 巨噬细胞特异性 AAV 小鼠模型完成体内功能验证，完整构建上下游调控通路并评估其作为治疗靶点的潜力。
研究结果
ox-LDL 刺激巨噬细胞、人动脉粥样硬化斑块、高脂 LDLR⁻/⁻小鼠主动脉中 SNO-HINT1 水平显著升高，HINT1 的 S - 亚硝基化修饰位点为 Cys84；C84 位点突变抑制 HINT1 亚硝基化后，巨噬细胞脂质摄取、胆固醇蓄积、泡沫细胞形成显著减少，仅下调 SR-A1 蛋白稳定性与 CD36 转录，不影响胆固醇外流；SNO-HINT1 经 CRM1 依赖途径发生核输出，胞质中增多的 HINT1 直接结合 SR-A1 胞质结构域，抑制 SR-A1 溶酶体途径降解；细胞核内 HINT1 减少后，解除对 USF2 的结合抑制，USF2 结合 CD36 启动子促进其转录；ox-LDL 特异性上调 iNOS，iNOS 是介导 HINT1 发生 S - 亚硝基化的必需酶；体内动物实验证实巨噬细胞 HINT1 C84 突变可显著缩小小鼠主动脉粥样硬化斑块、减少病灶巨噬细胞浸润及 SR-A1、CD36 表达。
研究结论
本研究完善了 S - 亚硝基化调控动脉粥样硬化泡沫细胞形成的全新分子通路，对比既往研究区分了 HINT1 在心肌细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞中的差异化功能，阐明其亚硝基化修饰通过改变核质分布双向调控 SR-A1 蛋白降解与 CD36 基因转录，同时补充 iNOS 介导的蛋白亚硝基化在粥样硬化中的致病机制，也指出 S - 亚硝基化存在双向血管调控作用，为靶向 SNO-HINT1 治疗动脉粥样硬化提供理论支撑；研究存在一定局限性：仅聚焦巨噬细胞内 HINT1 功能，未探究内皮、平滑肌细胞中 HINT1 亚硝基化的作用；仅验证 CD36 作为 USF2 下游靶基因，未系统性解析 SNO-HINT1 对 USF2 全基因组转录调控网络的影响；仅在小鼠模型开展体内验证，缺乏人体临床样本干预数据，后续可开展多细胞类型研究、转录组测序及临床队列验证，进一步推进靶点转化应用。
图文结果解读
Fig1：质谱与生物素置换实验鉴定 HINT1 的 S - 亚硝基化位点为 Cys84，同时在 ox-LDL 处理巨噬细胞、人粥样硬化斑块、高脂 LDLR⁻/⁻小鼠主动脉中验证 SNO-HINT1 表达显著上升，C84 突变更完全消除 HINT1 的亚硝基化修饰，证明粥样硬化病理环境下 HINT1 发生 Cys84 位点 S - 亚硝基化。 
Fig2：通过 C84 突变体对比实验证实 HINT1 的 S - 亚硝基化仅通过上调脂质摄取受体 SR-A1、CD36 促进 ox-LDL 诱导的巨噬细胞泡沫化，不影响胆固醇外流通路相关分子（ABCA1/ABCG1/SR-B1），SR-A1 调控发生在蛋白水平、CD36 调控发生在转录水平。 
Fig3：明确 SNO-HINT1 通过溶酶体通路调控 SR-A1 蛋白稳定性，而非蛋白酶体；分子对接、体外蛋白结合、截短质粒共 IP 证实 HINT1 直接结合 SR-A1 胞质结构域，ox-LDL 诱导的 HINT1 亚硝基化会增强二者相互作用，减少 SR-A1 溶酶体降解、提升 SR-A1 蛋白含量。 
Fig4：筛选并验证 USF2 是 CD36 关键转录因子，HINT1 可结合 USF2 抑制其转录活性；ox-LDL 诱导 HINT1 亚硝基化后，细胞核内 HINT1-USF2 结合减少，USF2 对 CD36 启动子的转录激活作用增强，C84 突变可逆转该效应。 
Fig5：ox-LDL 刺激促进 HINT1 从细胞核转运至细胞质，该核输出效应完全依赖 CRM1 转运蛋白；阻断 C84 亚硝基化或使用 CRM1 抑制剂 KPT-185 均可显著抑制 HINT1 出核，阐明亚硝基化调控 HINT1 核质分布的分子基础。 
Fig6：ox-LDL 仅诱导 iNOS 表达上调，eNOS、nNOS 无明显变化；iNOS 抑制剂 1400W 或 iNOS 敲除均可消除 ox-LDL 诱导的 HINT1 亚硝基化，并逆转下游 HINT1 核输出、HINT1-SR-A1 结合增强、泡沫细胞形成等全部表型，证实 iNOS 是上游催化酶。 
Fig7：体内骨髓移植联合巨噬细胞特异性 AAV 回补实验，巨噬细胞 HINT1 C84 突变能够显著降低高脂 LDLR⁻/⁻小鼠主动脉整体及主动脉根部粥样硬化斑块面积，减少病灶巨噬细胞浸润与 SR-A1、CD36 表达，在动物水平验证 SNO-HINT1 促动脉粥样硬化的病理作用。 
Fig8：机制模式图整合全文通路，直观展示 ox-LDL 上调 iNOS、催化 HINT1 C84 亚硝基化，修饰后 HINT1 经 CRM1 出核，分别在胞质稳定 SR-A1、在核解除对 USF2 的抑制上调 CD36，双重升高脂质摄取受体，加速巨噬细胞泡沫化并推动动脉粥样硬化进展。
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