南京大学黎书华教授和冯福德教授Angew.:一锅法将吖啶转化为光疗近红外螺花菁

螺环化作为一种荧光染料的结构修饰策略，已成为生物成像和治疗应用中一种变革性的工具。通过在两个平面芳香片段之间引入一个螺桥（例如碳原子或杂原子连接），螺环效应能够调控荧光团的关键性质。染料刚性的螺环骨架可限制分子转动、稳定空间几何构象并减少非辐射跃迁过程，从而提高成像亮度，特别是对于遭受严重荧光猝灭的近红外（NIR）染料，如吲哚菁绿（ICG）。螺环还可用于促进染料从激发单重态到三重态的系间窜越（ISC），从而增加活性氧（ROS）的产生，诱导癌细胞死亡。例如，以硼原子作为螺桥的螺环化氟硼二吡咯（BODIPY）染料，其产生的活性氧（单线态氧，¹O₂）是其非螺环化对应物的23.5倍。在另一个例子中，通过螺连接形成的一种近位斜向堆积（V形）七甲川菁染料（产生¹O₂的II型光敏剂）实现了高达约10¹¹ s⁻¹的创纪录ISC速率常数。因此，螺环化是一种多用途策略，无需复杂的分子设计策略和多步合成，就能协同增强荧光染料的成像灵敏度和治疗效果。然而，理解螺环在调节染料光物理和光化学性质中作用的分子机制在很大程度上仍不清楚。此外，如何通过逐步合成将螺环以正交方向安装到近红外菁染料等染料的骨架上，也是一项巨大挑战。

自由基化学是有机分子构建的一种有力工具。近年来，自由基化学也被应用于细胞内三甲川花菁（Cy3）和五甲川花菁（Cy5）骨架的构建，通过吲哚衍生物的伪三聚化反应，实现了从可见光到近红外区域的体外及体内荧光成像。然而，关于自由基在花菁形成反应网络中所起作用的机理研究仍有待阐明。通常，涉及多个自由基参与过程的反应网络过于庞大和复杂，难以通过人工方式构建。此外，人工建立的反应网络往往受到化学直觉的限制，导致与实际反应机理存在偏差。因此，系统地搜索基元反应步骤，并借助高效的自动化反应路径搜索方法构建复杂的反应网络，能够极大地帮助化学家理解反应机理、发现新的反应模式，并为新反应的设计提供灵感。在这方面，化学反应自动化设计（ADCR）程序提供了一个令人满意的解决方案（方案1a）。作为一个强大的软件包，ADCR程序配备了分子动力学与坐标驱动（MD/CD）相结合的方法，能够自动探索多种反应体系中的多步反应路径，包括涉及过渡金属/无金属参与的反应、单电子转移反应、自由基反应以及溶液中的反应。

方案1 (a) ADCR程序探索自由基串联反应机理的示意图（左）及一步法合成螺环花菁的展示（右）。(b) Me-SpiroCY相较于ADCy3的优势。

图1 SpiroCY的结构范围。

图2 (a) 反应混合物的紫外-可见吸收光谱。反应在有或无TEMPO以及氧气或氩气气氛下进行。(b) 1-TEMPO加合物的高分辨质谱表征。(c) TEMPO⁺的高分辨质谱表征。(d) ADCR程序在探索反应机理方面与传统机理计算相比的原理与先进性。(e) 在M06-2X/6-311+G(d,p)水平下计算的O₂介导生成自由基1·和HO₂·的自由能曲线。系间窜越速率常数在B3LYP/TZVP水平下计算。插图：在MRSF-M06-2X/def2-TZVPP水平下计算的由1-O₂H生成TS-4的自由能曲线。

图3 (a) O₂介导生成自由基1·和HO₂·的可能机理。(b) Me-SpiroCY转化的可能自由基串联反应（RCR）机理。

图4 (a) ADCy3晶体和(b) Me-SpiroCY晶体的单胞结构及分子堆积模式，图中标注了分子间距离。为清晰起见，碳原子上的氢原子及负离子均已省略。(c) Me-SpiroCY在甲醇中以单体形式（λex = 808 nm）和在Na2HPO4水溶液（100 mM）中以J-聚集体形式（λex = 980 nm）的归一化吸收和荧光光谱。

图5 (a) 含DCFH (50 μM)和花菁染料(2 μM)的反应混合物在808 nm光照射(tirr = 0−300 s)下的I/I₀变化。I₀和I分别表示光照射前后的荧光强度。λex = 488 nm; λem = 525 nm。(b) 含NIR-HR (40 μM)和花菁染料(2 μM)的反应混合物在808 nm光照射(tirr = 0−300 s)下的荧光波动。λex = 490 nm; λem = 632 nm。(c) 含DHR123 (20 μM)和花菁染料(2 μM)的反应混合物在808 nm光照射(tirr = 0−300 s)下的荧光波动。λex = 495 nm; λem = 526 nm。(d) ROS生成水平的比较。数据来源于(a)−(c)。(e) 在PBS中和(f) 在甲醇中，有或无808 nm光照射(tirr = 0−300 s)下的DMPO加合物的ESR谱图。(g) ADCy3和Me-SpiroCY的HOMO-LUMO能隙(ΔEg)及振子强度(f)。(h) 提出的ADCy3和Me-SpiroCY激发过程的雅布隆斯基图。(i) Me-SpiroCY相较于ADCy3的光物理与光化学机理。

图6 (a) 超亮线粒体靶向近红外成像与Me-SpiroCY光动力治疗示意图。(b) HeLa细胞与花菁染料(100 nM)孵育1.5小时后的荧光寿命成像(FLIM)图像。λex = 780 nm, λem = 825–1050 nm。(c) HeLa细胞与Me-SpiroCY (100 nM)孵育不同时间(0.5–4小时)后的FLIM图像。λex = 780 nm, λem = 825–1050 nm。(d) HeLa细胞与不同浓度(10–100 nM) Me-SpiroCY孵育2小时后的FLIM图像。λex = 780 nm, λem = 825–1050 nm。(e) 经花菁染料(200 nM)处理的HeLa细胞的近红外荧光成像。λex = 808 nm, λem = 1100–1700 nm (NIR-II)。(f) 经Me-SpiroCY (100 nM)和Mito-Tracker Green处理的HeLa细胞的FLIM图像。红色通道: λex = 780 nm, λem = 825–1050 nm。绿色通道: λex = 488 nm, λem = 502–547 nm。(g) 在无或有808 nm光照射(5分钟, 300 mW cm⁻²)条件下，经不同浓度ADCy3和Me-SpiroCY处理的HeLa细胞的活力。(h) 在NaAA (0或1 mM)存在下或在4°C条件下，经不同浓度Me-SpiroCY处理并施加808 nm光照射(300 mW cm⁻², 5分钟)的HeLa细胞的活力。(i) 使用DCFH-DA作为非特异性ROS探针，经花菁染料(200 nM)孵育后的HeLa细胞的荧光图像。808 nm光照射, 300 mW cm⁻², 5分钟。(j) 经Me-SpiroCY (200 nM)处理并光照射(5分钟, 300 mW cm⁻²)后的HeLa细胞的荧光成像。活细胞和死细胞分别用Calcein-AM和碘化丙啶染色。(k) 经Me-SpiroCY (200 nM)处理并光照射(5分钟, 300 mW cm⁻²)后的HeLa细胞的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。成像前细胞用JC-1染色。

总之，作者报道了一种新方法，仅在氧气气氛下使用9-甲基吖啶鎓盐作为前体，通过"一锅法"三聚化合成骨架上连有螺二氢吖啶的三甲川吖啶菁。单晶X射线衍射分析数据揭示，五元环呈共平面，而螺环结构中的二氢吖啶与相邻的吖啶杂环正交，赋予了吖啶菁结构增强的刚性和独特的三维几何构象。由ADCR程序驱动的理论计算和中间体捕获实验阐明了O₂在活性自由基（如单体自由基和HO₂·）产生过程中的关键作用，并展示了一条可能的自由基串联反应机理，从而对SpiroCY的转化过程形成深入理解。

本工作凸显了螺共轭效应对近红外菁染料光物理和光化学性质的显著改善。与近红外成像中多个参数表现不佳的母体染料相比，螺环组分的引入通过提升摩尔消光系数（ε）和荧光量子产率（ΦF）、提高光稳定性、抑制H-聚集、增大自旋轨道耦合常数、降低单重态-三重态能级差（ΔEST）、加快系间窜越速率常数（kISC）并促进I型光敏化过程，重塑了母体染料的光物理和光化学性质。这些源自于在菁染料骨架的“头颈”部位安装螺二氢吖啶的优势，为将母体菁染料（ADCy3）转化为治疗试剂（Me-SpiroCY）提供了有效的前提条件。

本研究新建立的螺环功能化策略，通过大幅增强肿瘤细胞中的近红外二区成像亮度，并在不依赖光热效应的情况下，通过产生超氧阴离子（O₂·⁻）和羟自由基（·OH）来提升抗肿瘤光动力治疗性能（在808 nm照射下IC₅₀达到纳摩尔水平），从而明确区分了Me-SpiroCY与ADCy3。此外，Me-SpiroCY固有的抗肿瘤活性是其在降低药物剂量方面的另一优势，而针对其治疗机制的生物学理解仍需进一步加强研究。

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