PBJ|南京农大高志红团队构建梅图形泛基因组解析柠檬酸积累分子调控机制
相信大家都听过‘望梅止渴’的历史典故。咬一口青梅，酸得味蕾发麻却越吃越上瘾——这颗让无数人又爱又恨的小果子，为何能成为蔷薇科的"酸味王者"？近日，南京农业大学梅创新团队在Plant Biotechnology Journal杂志发表的最新研究“Pangenome Analysis Reveals Structural Variations Associated With Citric Acid Accumulation in Prunus mume”，终于揭开了梅子酸溜溜的基因秘密，让这场跨越亿万年的"酸味进化"有了科学答案，也为未来酸时代果树育种提供了新的基因资源。梅为蔷薇科李属植物，典型的核果类果树，原产于我国西南部的花果兼用树种，有着悠久的历史，种质资源丰富。核果类果树中梅果实的有机酸含量远超桃子、杏子、李子等近缘物种，其中柠檬酸含量占60%以上，不仅赋予梅果实独特风味，更具有重要的营养保健价值，在食品加工和健康产业中占据重要地位。然而，长期以来，梅柠檬酸积累的遗传机制尚不明确，传统育种方式周期长、效率低，严重制约了优质梅品种的培育进程。该研究的发表，不仅填补了梅泛基因组研究的空白，更首次揭示了结构变异调控果实有机酸积累的全新机制，为分子设计育种提供了关键靶点。泛基因组作为捕捉物种全遗传多样性的研究工具，相比单一参考基因组能更全面地揭示物种遗传变异特征。研究团队针对梅基因组研究基础薄弱的现状，率先开展了大规模基因组组装工作。选取了11份具有广泛遗传多样性的梅核心种质资源，结合 HiFi、Oxford nanopore（ONT）和 Hi-C 等多种先进测序技术，成功组装了1个T2T单倍型基因组和10个染色体水平高质量基因组。其中，“PmNH_Hap1” 单倍型基因组大小为232.81 Mb，contig N50高达27.99 Mb，BUSCO完整性达 99.1%，达到当前植物基因组组装的“黄金标准”。在此基础上，研究团队整合2份已报道的西藏野生梅基因组，构建了梅首个图形泛基因组（图1）。泛基因组总长度达412.41 Mb，相比参考基因组新增179.60Mb 独特序列，包含 5918个新基因。基因家族分析显示，泛基因组包含25748个基因家族，其中核心基因家族16600个（占 64.47%），主要参与信号转导、转录调控和植物生长发育等基础生物学过程；非核心基因家族（包括软核心基因、可分配基因和私有基因）占35.53%，富集于环境胁迫响应、次生代谢物合成等特异性功能，为梅适应不同生态环境提供了遗传基础。图1 梅的泛基因组分析
为全面解析遗传变异特征，研究团队进一步整合了5 份杏（Prunus armeniaca）基因组，对18份核果类种质进行全基因组结构变异（SV）检测（图2），共鉴定出51461个非冗余结构变异，包括插入、缺失、易位和倒位四种类型。其中，60.50% 的存在/缺失变异（PAV）由转座子介导，证实转座子活动是梅基因组多样性形成的重要驱动力。结构变异在染色体上呈非均匀分布，主要集中在基因间区和基因上下游调控区，表明梅功能基因区域具有较高的进化保守性。泛基因组的构建为利用短读长测序数据检测群体水平的结构变异提供了可能。研究团队以 “PmNH_Hap1” 为参考基因组，整合18个高质量基因组的PAV信息，构建了梅与杏的泛基因组图谱，并对320份种质资源（190份梅、130份杏）进行了基于PAV的重测序分析。结果显示，320份样本的 PAV变异信息能够清晰区分梅和杏树两个物种，体现了物种间显著的遗传分化，这一结果不仅证实了 PAV 变异信息的可靠性，更为后续性状关联分析奠定了基础。通过将PAV数据与柠檬酸含量等表型数据关联，研究团队成功缩小了候选基因的筛选范围，为精准定位柠檬酸积累相关的关键变异提供了有力支撑。同时，为揭示梅与杏树在长期进化中适应性差异的遗传基础，研究团队基于PAV数据进行了选择性清除分析，有 213个基因同时存在于两类选择性清除区域中，这些基因主要富集于环境刺激响应、脂肪酸生物合成、生长素激活信号通路以及糖酸合成与转运等通路。这一结果与梅和杏在分布范围、果实品质等方面的显著差异高度契合，表明这些基因在物种特异性适应和重要农艺性状形成中发挥了关键作用。其中，与糖酸代谢相关的基因更是为解析梅柠檬酸高积累特性提供了重要的进化线索。图2 全基因组的结构变异检测
柠檬酸作为梅果实的主要有机酸成分，其含量显著高于杏等其他核果类果树，是梅的核心品质性状。研究团队通过多组学整合分析，成功破解了这一特异性状的遗传密码。首先，研究团队对梅果实不同发育阶段进行转录组测序，结合加权基因共表达网络分析（WGCNA），筛选出与柠檬酸含量高度相关（相关系数 0.96）的绿色模块，包含256个核心基因（图3）。同时，通过全基因组关联分析（PAV-GWAS）鉴定到74个与柠檬酸积累相关的候选位点。进一步结合梅与杏的比较基因组学分析，最终锁定3个关键候选基因，其中MYB转录因子编码基因 Hap1.Pmu000041与柠檬酸含量的相关性最高（r=0.98），被命名为PmPH4。序列分析发现，梅PmPH4基因启动子区697 bp处存在一个376 bp的结构变异（SV）插入片段，而这一插入在杏树及其他核果类果树中均不存在。重测序分析和PCR验证结果显示，该结构变异在190份梅材料中均稳定存在，在130份杏材料中完全缺失，表明该变异是梅特有的遗传标记。图3 梅果实柠檬酸积累显著关联的SV
功能验证实验进一步证实了PmPH4基因的核心作用。研究团队构建PmPH4过表达载体，在烟草叶片和青梅果实中过表达PmPH4，过表达植株的柠檬酸含量显著高于对照。双荧光素酶报告实验显示，含有SV插入的PmPH4启动子活性显著增强，而缺失该插入的杏树PaPH4启动子活性极低。这表明启动子区的结构变异通过增强基因表达，促进柠檬酸积累。为解析结构变异的分子调控机制，研究团队通过PlantTFDB预测发现，该SV片段包含MADS、bZIP、MYB等多个转录因子结合的顺式作用元件。利用机器学习和基因共表达分析，筛选到关键转录因子PmAGL30。酵母单杂交和双荧光素酶实验证实，PmAGL30能够特异性结合PmPH4启动子区的SV片段，显著激活PmPH4基因表达，从而形成 “结构变异-转录因子结合-基因激活-柠檬酸积累” 的调控通路（图5）。这段看似不起眼的376bp的插入片段，就像给酸味基因装了个“放大器”，能让转录因子PmAGL30精准绑定，大幅增强PmPH4的表达，催生出大量柠檬酸。下次咬下青梅时，不妨想想这藏在果肉里的基因小秘密：正是这376bp的“进化馈赠”，让梅子成为独树一帜的酸味代表，在舌尖上留下了跨越千年的清爽记忆。这一发现首次揭示了结构变异通过招募转录因子调控果实有机酸积累的全新机制，为核果类果树品质改良提供了新的思路。图5 PmPH4基因的功能验证和分子调控机制研究
为明确PmPH4基因及结构变异的育种应用价值，研究团队对不同基因型材料的表型特征进行了系统分析。含有 SV 插入的梅纯合基因型（SV/SV）果实柠檬酸含量显著高于杂合基因型（SV/-）和无插入基因型（-/-）的杂交后代及杏材料。同时，PmPH4 基因表达水平随果实发育逐渐升高，与柠檬酸积累趋势高度一致，证实该基因对柠檬酸积累的持续调控作用。基于此，研究团队成功开发了梅高柠檬酸含量的分子标记。该标记可通过常规PCR技术快速检测，实现对梅种质资源的早期筛选。传统梅育种中，柠檬酸含量需等到果实成熟后才能测定，育种周期长达3-5年。而利用该分子标记，可在幼苗期直接鉴定基因型，快速筛选高柠檬酸含量单株，将育种周期缩短至1-2年，显著提高育种效率。实验验证显示，该标记的筛选准确率达95%以上，在梅与杏的杂交后代中同样适用，为杂交育种提供了精准的选择工具。南京农业大学园艺学院钟山青年研究员黄霄和博士生林熙蒙共同为论文第一作者，南京农业大学园艺学院高志红教授和农学院万建民院士为论文通讯作者。南京农业大学科研助理周鹏羽，博士研究生谭伟、高峰、白杨、马成栋，硕士研究生马瑜梵、李眀潞，侍婷副教授，倪照君高级农艺师，阿联酋大学Faisal Hayat博士参与了本研究的工作。同时，北京林业大学张启翔教授和日本京都大学Ryutaro Tao教授参与了相关工作，南京农业大学吴瑶瑶教授对本研究提出了宝贵的意见。本研究得到了国家自然科学基金项目（32502637和32372670），江苏省种业振兴项目（JBGS [2021] 019），中央高校基本科研业务费专项资金（KYZZ2025006），中国博士后科学基金面上项目（2023M731734），江苏省卓越博士后项目（2023ZB729）和江苏省高等教育机构优势学科项目（PAPD）的资助和支持。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70518
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