南京医科大学金陵医院 | 揭秘 DN 发病新机制:UHRF1 双调控 GRP78 失衡,核转运抑制剂带来肾脏保护新希望

研究亮点

首次发现表观调控因子 UHRF1 对 GRP78 的双重表观调控机制（启动子甲基化 + 蛋白泛素化）；明确 GRP78 经 importin β1 介导核转运并作为转录调控因子激活 ER 应激 / 凋亡通路；通过双平台筛选获得特异性 GRP78 核转运抑制剂 Parishin，其在保留 GRP78 生理功能的同时阻断病理作用，为 DN 提供了精准靶向治疗新策略。

研究背景

糖尿病肾病（DN）是糖尿病患者常见并发症，约 20%-40% 糖尿病患者会患病，且是终末期肾病的主要诱因，肾小管上皮细胞（RTEC）损伤在 DN 进展中起关键作用。代谢应激导致内质网（ER）稳态失衡，引发 ER 应激介导的细胞凋亡，是 DN 发病的重要病理机制，临床研究也证实 ER 应激标志物与 DN 患者蛋白尿及肾小管损伤相关。GRP78 作为核心 ER 分子伴侣，对维持 ER 稳态至关重要，高糖环境下其表达异常上调，但调控机制及功能作用尚未完全明确。此外，GRP78 可在应激下转运至胞外或细胞器发挥非经典功能，但其在 DN 中是否发生核转运及生物学意义仍不清楚，亟需揭示相关调控网络，为 DN 治疗提供新靶点。

• 样本来源：收集 DN 患者与健康对照肾活检组织、db/db 自发糖尿病肾病小鼠及 db/m 对照小鼠肾组织；

• 细胞模型：采用人肾小管上皮细胞（HK-2）、大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E），经高糖（HG）持续培养构建细胞损伤模型；

• 分子生物学技术：通过 DNA pull-down、Co-IP、GST 下拉验证蛋白相互作用；采用甲基化特异性 PCR、Bisulfite 测序分析启动子甲基化；利用 Western blot、RT-qPCR 检测基因表达；通过 CUT&Tag 鉴定 GRP78 靶基因；

• 筛选与验证：结合分子对接与深度学习的双平台策略，从 210 万化合物库中筛选 GRP78 核转运抑制剂，经细胞毒性、SPR 结合实验及功能验证；

• 动物实验：db/db 小鼠经 Parishin 灌胃处理，检测肾功能指标、病理改变及相关分子表达；

• 统计学分析：采用 GraphPad Prism 9 进行 t 检验、单因素 / 双因素方差分析。

研究结果

• 高糖环境下 HK-2 细胞 GRP78 显著上调，伴随 ER 应激通路激活及细胞凋亡增加，DN 患者及 db/db 小鼠肾组织中 GRP78 表达随病情进展升高；

• UHRF1 可结合 GRP78 启动子抑制其转录（依赖 H3K9me2/3 结合及半甲基化 CpG 结合活性），并通过与 GRP78 底物结合域（SBD）相互作用介导其 K48 连接泛素化降解，高糖诱导 UHRF1 下调导致 GRP78 蓄积；

• GRP78 依赖核定位信号（NLS）与 importin β1 结合进入细胞核，核内 GRP78 结合 ER 应激 / 凋亡相关基因（ATF6、XBP1 等）启动子，激活转录；

• 高通量筛选获得抑制剂 Parishin，其与 GRP78 NLS 域高亲和力结合，阻断核转运，且不影响 GRP78 胞质分子伴侣功能；

• Parishin 处理可显著降低 db/db 小鼠肾功能指标（血尿素氮、尿白蛋白 / 肌酐比等），减轻肾小球肥大、肾小管萎缩等病理改变，抑制 ER 应激与凋亡。

Figure 1：高糖诱导肾小管细胞 GRP78 上调加剧内质网应激

该图通过多维度实验验证了高糖环境下 GRP78 与糖尿病肾病（DN）中内质网（ER）应激的关联。首先，火山图分析显示高糖持续培养 10 代的 HK-2 细胞中，ER 应激相关基因 HSPA5（编码 GRP78）显著上调，KEGG 通路富集分析证实差异基因主要集中在 ER 蛋白加工、未折叠蛋白反应等通路。其次，临床样本数据表明，DN 患者肾小管中 HSPA5 mRNA 和 GRP78 蛋白表达随疾病分期（G1 至 G4）和病理损伤程度逐渐升高。细胞实验进一步显示，高糖（30/55 mM）处理可诱导 HK-2 细胞 GRP78 和损伤标志物 KIM1 表达增加，且 ER 应激诱导剂毒胡萝卜素能进一步放大 GRP78 水平。功能验证中，GRP78 过表达可激活 ATF6、IRE1α、XBP1-s 等 ER 应激通路关键分子及 CHOP、裂解型 caspase3 等凋亡标志物，而 GRP78 敲低则能减轻高糖诱导的 ER 应激和凋亡，明确 GRP78 积累是驱动 DN 肾小管损伤的病理性事件。

Figure 2：UHRF1 通过调控 GRP78 启动子甲基化调节其表达

该图聚焦 UHRF1 对 GRP78 的转录水平调控机制。DNA pull-down 结合质谱和 Western blot 证实，UHRF1 可直接结合 GRP78 启动子区域（–755 至 10 bp）。功能实验显示，UHRF1 过表达能显著降低 HK-2 和 NRK-52E 细胞中 GRP78 的 mRNA 和蛋白水平，而 UHRF1 敲低则促进 GRP78 表达，且 UHRF1 可抑制 GRP78 启动子的荧光素酶活性。DNA 去甲基化药物 5 - 氮杂胞苷处理后，UHRF1 对 GRP78 的抑制作用减弱，表明其调控依赖甲基化机制。甲基化特异性 PCR 和亚硫酸氢盐测序结果显示，UHRF1 过表达可增加 GRP78 启动子甲基化水平，而 DN 患者和 db/db 小鼠肾组织中 GRP78 启动子呈低甲基化状态。进一步构建 UHRF1 突变体发现，其对 GRP78 启动子甲基化的调控需要同时具备 H3K9me2/3 识别活性（YP191/192 位点）和半甲基化 CpG 结合活性（YT478/479 位点），缺失任一活性均会部分削弱调控效果，双重突变则完全丧失调控功能。

Figure 3：UHRF1 通过与 GRP78 的 SBD 结构域相互作用介导其 K48 连接泛素化

该图揭示了 UHRF1 对 GRP78 的翻译后调控机制。尽管 UHRF1 双重突变体（YP191/192AA+YT478/479AA）丧失了甲基化调控能力，但仍能抑制 GRP78 蛋白水平，提示存在额外调控方式。Co-IP、GST 下拉实验及免疫荧光证实，UHRF1 与 GRP78 在细胞质中直接相互作用。泛素化实验显示，UHRF1 过表达可增强 GRP78 的泛素化修饰，且特异性介导 K48 连接型泛素化（对 K63 连接型无影响），提示其通过蛋白酶体途径降解 GRP78。结构域映射实验表明，GRP78 的底物结合域（SBD，300–645 aa）是与 UHRF1 相互作用的关键区域，缺失 SBD 的 GRP78 突变体无法与 UHRF1 结合，也不能被其诱导 K48 连接泛素化。DMFold 结构预测进一步验证了 GRP78 SBD 与 UHRF1 之间的氢键相互作用，明确 UHRF1 作为 E3 泛素连接酶，通过与 GRP78 的 SBD 结合介导其泛素化降解。

Figure 4：UHRF1 以 GRP78 依赖的方式调控肾小管上皮细胞的内质网应激和凋亡

该图验证了 UHRF1-GRP78 轴在调控 ER 应激和细胞凋亡中的功能关联性。临床样本和动物实验显示，DN 患者肾小管上皮细胞（RTECs）中 UHRF1 表达随疾病进展逐渐降低，且与 GRP78 表达呈显著负相关（r=-0.7773），db/db 小鼠肾组织中 UHRF1 水平也明显低于 db/m 对照小鼠。细胞实验中，UHRF1 过表达可降低 GRP78 水平，同时抑制 ER 应激标志物（ATF6、IRE1α、XBP1-s、PERK）和凋亡标志物（CHOP、裂解型 caspase3）的表达；反之，UHRF1 敲低则上调上述分子。XBP-1/EGFP 报告系统显示，高糖诱导的 XBP-1 剪接（ER 应激标志）可被 UHRF1 过表达抑制，且该效应能被 GRP78 过表达逆转，而 UHRF1 敲低加剧的 XBP-1 剪接可通过 GRP78 沉默恢复。蛋白复性实验证实 GRP78 具有保护变性蛋白复性的功能，而 UHRF1 可削弱该功能。关键的拯救实验显示，UHRF1 敲低诱导的 ER 应激和凋亡激活，在同时敲低 GRP78 后被完全阻断，直接证明 UHRF1 对 ER 应激和凋亡的调控依赖于 GRP78。

Figure 5：GRP78 积累通过 importin β1 介导的核转运加剧高糖环境下肾小管上皮细胞的内质网应激和凋亡

该图阐明了 GRP78 核转运的机制及其病理功能。免疫组化结果显示，DN 患者和 db/db 小鼠的肾小管细胞中，除细胞质外，GRP78 在细胞核内显著积累，且该现象在急性肾损伤、IgA 肾病等其他肾小管损伤疾病中也存在。细胞实验证实，高糖、转化生长因子 -β、顺铂等损伤因素可诱导 GRP78 从内质网周围向细胞核转移，核蛋白提取实验进一步验证了这一结果。UHRF1 敲低虽能增加 GRP78 核转运，但 GRP78 的 SBD 缺失突变体仍可正常核转运，且不受 UHRF1 调控，表明 UHRF1 不直接参与 GRP78 核定位。序列分析发现 GRP78 存在保守的核定位信号（NLS，276–287 aa），突变该区域的赖氨酸残基（GRP78-mut-KA/GRP78-mut-KR）可显著抑制其核转运。核提取物质谱分析结合 Co-IP 证实，GRP78 通过 NLS 与 importin β1（KPNB1）特异性结合，importin α3/α4 不参与该相互作用，且 importin β1 敲低或药物抑制（伊维菌素）能有效阻断 GRP78 核转运。功能实验显示，GRP78-WT 过表达可激活 ER 应激和凋亡通路，而核转运缺陷的 GRP78-mut-KA 则无此效应，证实 GRP78 的核定位是其诱导病理损伤的关键。

Figure 6：核定位的 GRP78 调控内质网应激和凋亡相关基因的转录程序

该图通过 CUT&Tag 技术揭示了核 GRP78 的转录调控功能。GRP78 过表达的 HK-2 细胞中，CUT&Tag 分析鉴定出 24766 个 GRP78 结合峰，其中 46.8% 定位于基因启动子区域（转录起始位点上游≤3 kb），提示 GRP78 作为转录调控因子发挥作用。KEGG 通路富集显示，GRP78 结合的启动子主要富集于 ER 蛋白加工和凋亡通路，包括 CANX、RBX1、ATF6、XBP1、RIPK1、CASP3 等关键基因。RT-qPCR 和荧光素酶报告实验证实，GRP78 过表达可显著上调这些靶基因的 mRNA 表达和启动子活性，而 importin β1 敲低能逆转该效应。ChIP 实验进一步验证，GRP78 可直接结合这些基因的启动子区域，且核转运缺陷的 GRP78-mut-KA 无法结合这些启动子。 motif 分析鉴定出 GRP78 特异性的 DNA 结合基序（如 ATTGG、CGAA 等），且其结合模式与 KLF5、KLF15 等 ER 应激 / 凋亡相关转录因子存在关联，提示 GRP78 可能通过与这些转录因子协同作用激活靶基因转录。

Figure 7：高通量虚拟筛选鉴定 Parishin 为 GRP78 核转运抑制剂

该图描述了 GRP78 核转运抑制剂的筛选及验证过程。采用分子对接与深度学习相结合的双平台策略，以 GRP78 的 NLS 结构域（276–287 aa）为靶点，从 210 万化合物库中筛选出 5 个候选化合物。细胞毒性实验显示，这些化合物在治疗浓度下对 HK-2 细胞活力无显著影响。Western blot 和免疫荧光验证发现，仅酚苷类化合物 Parishin 能特异性抑制高糖诱导的 GRP78 核转运，对细胞质 GRP78 水平无明显影响。SPR 分析显示 Parishin 与 GRP78 NLS 的结合亲和力为 Kd=3.52 μM，分子对接表明其通过与 NLS 域的 K280、D281、N282 残基形成氢键发挥作用。Co-IP 证实 Parishin 可减弱 GRP78 与 importin β1 的相互作用。功能实验显示，Parishin 能有效抑制高糖诱导的 ER 应激（ATF6、IRE1α 等）和凋亡（CHOP、裂解型 caspase3），且疗效优于 GRP78 敲低。蛋白复性实验证实，Parishin 处理不影响 GRP78 的细胞质分子伴侣功能，其优势在于选择性阻断 GRP78 核转运的病理作用，同时保留其生理保护功能。

Figure 8：Parishin 通过抑制 GRP78 核转运缓解糖尿病肾病进展

该图通过动物实验验证了 Parishin 的体内治疗效果。db/db 小鼠经 Parishin 灌胃处理 8 周后，肾功能指标（血尿素氮、血清肌酐、尿酸、尿白蛋白 / 肌酐比）显著改善，尿中肾小管损伤标志物 KIM1 和 NGAL 水平降低。病理分析显示，Parishin 能有效减轻 db/db 小鼠的肾小球肥大、系膜基质扩张和肾小管萎缩，降低肾组织中纤连蛋白（FN）和 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，同时部分恢复足细胞标志物 WT-1 和突触足蛋白的表达。关键机制验证显示，Parishin 可显著抑制 db/db 小鼠肾组织中 GRP78 的核转运，同时降低 ER 应激标志物 CHOP 的表达，Western blot 和 RT-qPCR 进一步确认了相关分子的表达变化。此外，Parishin 对 db/db 小鼠的体重和糖耐量无显著影响，但可轻度改善胰岛素敏感性，表明其肾脏保护作用独立于代谢调控，主要通过抑制 GRP78 核转运、减轻 ER 应激和凋亡实现。

研究结论

本研究阐明了 DN 中 GRP78 异常调控的关键机制：高糖诱导 UHRF1 下调，破坏其对 GRP78 的启动子甲基化抑制及泛素化降解双重调控，导致 GRP78 胞质蓄积并经 importin β1 介导核转运，核内 GRP78 作为转录调控因子激活 ER 应激与凋亡通路，加剧肾小管上皮细胞损伤。筛选获得的 Parishin 可特异性阻断 GRP78 核移位，在保留其生理伴侣功能的同时改善 DN 病理损伤。该研究揭示了 UHRF1-GRP78 - 核转运轴在 DN 中的核心作用，为 DN 提供了新型治疗靶点，且 Parishin 具有良好的临床转化潜力。

局限性：未明确 GRP78 与核内转录因子的协同作用机制，缺乏临床样本中 Parishin 疗效验证。展望：后续可深入探究 GRP78 核内转录调控的分子网络，开展 Parishin 的临床前药代动力学及毒理学研究，同时探索该调控通路在其他 ER 应激相关疾病中的作用，拓展应用场景。