南京雷正医药申请了促进肝脏再生或减少或预防肝细胞死亡的蛋白激酶MKK4抑制剂专利

背景技术

肝病可由感染、损伤、暴露于有毒化合物(如酒精或药物)、自身免疫过程、遗传缺陷和其它因素引起。肝脏具有显著的再生能力，然而，其在疾病状态下可能受损，并且可能因此不足以补偿肝细胞和器官功能的丧失。

WO2007/002433描述了作为蛋白激酶抑制剂的化合物，其可用于治疗与蛋白激酶的异常活性相关的疾病和病症。这些化合物是Raf蛋白激酶，特别是B-Raf和C-Raf及其突变的抑制剂，并且因此可用于癌症治疗。此外，据说它们抑制多种其它蛋白激酶，其中包括c-Jun N-末端激酶(JNK)，特别是JNK1。WO2007/002325具有类似的公开内容，WO2012/109075和WO2014/194127公开了具有Raf蛋白激酶抑制活性的修饰的化合物。H.Vin等人提及作为B-Raf抑制剂的WO2007/002433的两种化合物，其通过JNK信号传导的脱靶抑制来抑制细胞凋亡。WO2012/136859公开了一些化合物，其被描述为丝裂原活化蛋白激酶4(MKK4)的抑制剂并且可用于治疗肝衰竭，用于保护肝细胞免于凋亡以及用于肝细胞再生。Wuestefeld等人(细胞(Cell)153:389-401,2013)描述了用于鉴定可用于增加肝细胞的再生能力的基因靶标的功能性遗传方法。特别地，Wuestefeld等人鉴定蛋白激酶MKK4作为肝再生的关键调节剂，并报告MKK4抑制通过MKK7的代偿性上调和ATF2和ELK1的JNK1依赖性活化增加肝细胞再生。基于现有技术的发现，已经得出MKK4和JNK1抑制剂可用于治疗JNK1介导的疾病的结论。

发明内容

本发明的目的是提供一类新型的MKK4受体抑制活性和/或具有良好药效学/药代动力学性能的可作为MKK4受体拮抗剂的新颖化合物及其可药用盐，以及其在治疗或减轻MKK4受体相关疾病如急性和慢性或慢加急性肝病，代谢性肝病等MKK4受体介导的疾病中的用途。

实施例10：生物活性测定

激酶活性采用竞争性结合的方法进行，该测定定量测量待测化合物与固定的活性位点定向配体竞争的能力。该测定通过组合三种组分进行：DNA标记的激酶；固定化配体；和待测化合物。通过DNA标签的定量PCR测量待测化合物与固定化配体竞争的能力。(Nat.Biotechnol.,23,329-336(2005)；Nat.Biotechnol.,26,127-132(2008))。为了表征对MKK4、MKK7和JNK1的亲和力，在HEK-293细胞中产生激酶并且随后用DNA标记以用于qPCR检测。将链霉抗生物素蛋白包被的磁珠用生物素化的小分子配体在室温处理30分钟以产生用于激酶测定的亲和树脂。用过量生物素封闭配体珠且用封闭缓冲液(SEABLOCKTM(Pierce)，1％BSA，0.05％吐温20，1mM DTT)洗涤以去除未结合配体且减少非特异性结合。通过在1x结合缓冲液(20％SEABLOCKTM，0.17xPBS，0.05％吐温20，6mM DTT)中组合激酶、配体亲和珠和待测化合物来组装结合反应。所有反应均在聚苯乙烯96孔板中以0.135mL的终体积进行。将测定板在室温下振荡孵育1小时，并将亲和珠用洗涤缓冲液(lx PBS，0.05％吐温20)洗涤；然后将珠粒再悬浮于洗脱缓冲液(lx PBS，0.05％吐温20，0.5 11M非生物素化的亲和配体)中，并在室温下振荡温育30分钟。通过qPCR测量洗脱物中的激酶浓度。

效价测试

在指定浓度筛选待测化合物并将结合相互作用的结果报告为[对照的％]，其中较低的数字表示较强的结合，即较高的效价。待测化合物以10mM储备溶液提供。在DiscoverX制备所示终浓度的测试溶液。结果在下表1中给出。涉及的“对照”是指阴性对照。

在表1中示出了针对待测化合物(本发明的实施例以及参照化合物)针对蛋白激酶MKK4、MKK7、JNK1的效价，表示为对照结合的残余百分比(PoC)。

表1.本发明的实施例以及参照化合物活性测定的数据

HepaRegeniX公司的HRX-215是一种MKK4抑制剂，在临床前模型中能够促进肝脏再生。HRX-215也已完成I期临床试验。该试验表明，HRX-215在健康受试者中具有良好的安全性和耐受性。目前正在进行 Ib/IIa 期临床试验，旨在预防癌症患者的肝衰竭。

主要临床和临床前研究结果：

肝脏再生：研究表明，HRX-215 可促进肝脏再生。在动物模型中，即使在致命的情况下，它也能帮助预防大范围肝切除术后的肝功能衰竭。

I期临床试验（健康受试者）：该试验已成功完成。HRX-215耐受性良好，未报告任何与药物相关的严重不良事件。这证实了其良好的安全性和药代动力学特征。

机制： HRX-215抑制MKK4，利用人体自身的肝脏再生途径，并保护肝细胞免于死亡。

目前进展：一项 Ib/IIa 期临床试验正在进行中。该试验针对结直肠癌肝转移患者，旨在评估该疗法在预防肝切除术后肝功能衰竭 (PHLF) 方面的安全性和有效性。

“HRX-215 可能通过促进肝细胞再生提供一种新的治疗选择，从而提高术后预计肝脏质量不足和/或肝功能因脂肪肝（脂肪变性）或肝瘢痕（纤维化）而下降的患者进行肝切除术的安全性和可行性。”