Microbiol. Res.│南京林大黄麟/孙辉团队:综合宏基因组学和非靶向代谢组学揭示不同管理措施下桉树人工林中的微生物多样性和代谢响应

DOI号：10.1016/j.micres.2025.128381

1根际土壤微生物群落结构

研究显示，α多样性分析显示，MF的微生物α多样性（Ace指数）高于PS（P< 0.05；图1A）。然而，辛普森指数显示不同组间无显著差异。在微生物多样性方面，MF（24,647种）招募的微生物种类数量最多，其次为PF（24,102种）、MS（22,522种）和PS（22,204种）（图1B）。在PF中招募的独有物种数量最高，其次是MF、PS和MS。主成分分析表明，PF与PS、PF与MS、PS与MF、MF与MS的根际微生物群落之间存在显著差异（图1C和表S4）。然而，PF和MF、PS和MS的微生物群落结构之间没有显著差异。与PF相比，PS导致多种微生物的相对丰度存在显著差异，而混栽引起的微生物相对丰度存在显著差异的种类则较少（图S2）。

在门水平上，放线菌门、变形菌门和酸杆菌门是丰度最高的细菌门，而子囊菌门、担子菌门和毛霉门在真菌群落中占主导地位（图1D和1E）。PS中的变形菌门相对丰富度高于PF。在PF、PS和MF中，丰富度排名前10的真菌无显著差异（P> 0.05）。物种指示分析表明，芽单胞菌门（相对丰度：PF: 0.13%，PS: 0.39%，MF: 0.14%，MS: 0.21%）是PS的指示物种（图S3），而Microthyriales被确定为MS的指示物种。在细菌科水平上，PF富集了酸杆菌科、 Treboniaceae、链霉菌科，而MF富集了链孢囊菌科，PS富集了黄色杆菌科。在真菌科水平上，PF富集了毛盘菌科和暗色孢科，而MS富集了Pyriculariaceae。

图1微生物群落结构的改变。（A）各组微生物群落α多样性指数（n = 4）。（B）各组中独有和共有微生物物种分布的upset图（n=4）。(C) 主成分分析展示微生物群落结构差异（n = 4）。排名前十的细菌门(D) 和真菌门(E)的相对丰度。小写字母表示不同组间存在统计学显著差异 (P< 0.05, n = 4)。缩写：PF：单一栽培桉树的人工林、MF：桉树与固氮树种马占相思混栽的人工林、PS：第二代桉树单一栽培人工林、MS：第二代桉树与固氮树种降香黄檀混栽的人工林。

2微生物共现网络

微生物共现网络分析显示，放线菌门在网络中占主导地位，占总连接的39.92%（图2A）。与PF相反，PS的网络边数显著减少，表明微生物网络互连性较低（图2B）。MF和MS的共现网络平均连接长度比PF短，表明微生物间相互作用更加高效。此外，MF、PS和MS中的中介中心势（衡量网络中某些节点重要性的指标）低于PF。

图2微生物共现网络及其拓扑特征。（A）各组微生物物种的共现网络。线条代表物种间的

相关性，节点大小对应连接度的高低，节点颜色表示在门级分类下的物种类别。（B）-（E）植林共现网络中节点、边、平均连接长度以及中介中心势的拓扑特征。星号表示不同比较组之间存在显著差异（*:P< 0.05，**:P< 0.01，***:P< 0.001，n = 4）。

3根际土壤微生物群落功能

基因多样性分析显示，PS的基因多样性（辛普森指数）高于PF（P < 0.05），尽管各组之间的基因丰富度（Ace指数）差异不显著（图3A）。基因多样性和丰富度在单一种植和混栽人工林之间无差异。基于基因丰度的主成分分析表明，与PF和MF相比，PS林形成了独特的群落基因结构（图3B）。差异基因分析显示，与PS相比，PF中与碳固定相关的基因（rbcL、ppc）和磷循环相关的基因（phoP、ppk2）的丰度更高，但与碳固定相关的基因（frdA、pycB）、氮循环相关的基因（nrtA、nrtB、nrtC和gdhA）以及磷循环相关的基因（phnN、ugpB和ppgK）的丰度较低（图3C）。与MF相比，PS中与碳固定相关的基因（accD）、甲烷氧化相关的基因（fdoG、fdoH和fdoI）、氮循环相关的基因（napA、napC、nrfA、nrtA、nrtB和ureC）以及磷循环相关的基因（phoD、phoR、phnC、ugpB和ppk1）的丰度均有所增加，而与碳固定相关的基因（rbcS）的丰度则有所降低。功能分析表明，与PS和MF相比，PF的功能分析结果无显著差异。然而，相较于PS，MF的羟基丙酸酯生物循环和有机磷矿化功能有所降低（图3D）。

图3微生物群落功能的动态变化。(A) 参与碳、氮、磷循环的功能基因的α多样性指数。(B)不同组间的功能基因谱，揭示微生物群落功能结构的主成分分析。(C) 环形热图展示与碳、氮、磷循环相关的基因相对丰度。(D) 环形热图展示与碳z、氮、磷循环相关的功能相对丰度。小写字母表示不同组间存在统计学显著差异 (P< 0.05, n = 4)。

4桉树根际土壤的非靶向代谢组学

偏最小二乘判别分析显示，PF和PS之间的代谢物谱存在显著分离，PS的代谢物谱也与MF和MS明显不同（图4A和表S5）。在所有实验组中总共鉴定出共有代谢物1408种，PF包含的独有代谢物数量最多（68种），其次是PS、MF和MS（图4B）。与PF相比，PS、MF和MS分别增加了126、68和117种代谢物的数量，同时分别减少了129、162和446种代谢物的数量（图S4）。

差异代谢物分析显示，与PF相比，PS中2,4-二氯-6-硝基苯酚和PA (15:0/14:1(9Z))的含量较高，但双羟氟轻松和利多卡因的水平较低（图4C）。与PF相比，MF表现出2,4-二氯-6-硝基苯酚水平升高，以及黄绿青霉素和利多卡因代谢物水平降低。通路富集分析显示，与PF相比，MF富集了核苷酸代谢通路（图4D）。与PF相比，MS显示出多条通路的富集，包括核苷酸代谢、类固

醇激素生物合成、苯丙烷生物合成和黄酮类生物合成通路。

图4桉树根际土壤代谢物变化。（A）主成分分析展示了各组样品中代谢物结构。(B) 韦恩图展示各组样品中独有与共有的代谢物数量。(C) 热图展示了各比较组间排名前10的显著差异代谢物。(D)显著富集代谢物的KEGG通路分析。星号表示不同处理组之间存在显著差异（*：P< 0.05，**：P< 0.01，***：P< 0.001，n = 6）。

5微生物群落、功能与代谢物之间的关系

代谢产物双羟氟轻松与C、N和P循环的功能组分之间表现出负相关，而刺囊酸和bezitramide则与这些相同的功能成分表现出正相关（图5A）。已识别到下列代谢物之间的关联：Lusitanicoside与2,4-二氯-6-硝基苯酚、PA(15:0/14:1 (9Z))、bezitramide、甘草利酮以及(1S,3R,4R)-8,10-Dihydroxyfenchone10-O-β-D-葡萄糖苷呈负相关（图5B）。甘草利酮与2,4-二氯-6-硝基苯酚、PA(15:0/14:1(9Z))和刺囊酸显示出正相关。在微生物群落、功能和代谢物组成的更广泛分析中，2,4-二氯-6-硝基苯酚、黄曲霉毒素B1和(1S,3R,4R)-8,10-Dihydroxyfenchone10-O-β-D-葡萄糖苷与微生物组成正相关。

图5根际微生物与代谢产物之间的关联。（A）展示微生物碳、氮、磷功能及其主要差异代谢物之间关系的相关性热图。(B) 主要差异代谢物、碳氮磷循环相关微生物群落与功能及基因之间的关联。星号表示不同组之间的显著差异（*：P< 0.05，**：P< 0.01，***：P< 0.001，n = 4）。

1. 桉树根际微生物群落

根际微生物在植物生理学中扮演着至关重要的角色，强调了研究其在桉树林中动态变化的重要性。本研究揭示，PF与PS、PF与MS、PS与MF间根际微生物群落存在显著差异，突显了连作与间作对根际微生物群落的影响。桉树单一栽培减少了微生物物种的招募，而混栽人工林则增强了微生物物种的招募，增加了微生物的多样性。本研究结果与先前的研究相吻合，这些研究表明连续耕作会耗尽土壤营养物质并积累有害代谢物，从而对微生物群落产生负面影响。连续种植加剧了竞争压力，并形成单调的环境，从而对减少微生物多样性提供多样化的生态位构成挑战。相比之下，混栽人工林提供了更为多样化的生态环境，促进了微生物多样性的提升。在各组样品之间，细菌门水平的相对丰度存在显著差异，而真菌在门水平的丰度变化则微乎其微。这可能是由于真菌对有机物的依赖性所致。尽管本研究显示不同组间的代谢物存在显著差异，但差异代谢物和独有代谢物的种类相对较少。真菌主要受到宿主植物桉树的影响，这可能是真菌丰度相对变化较小的主要原因。芽单胞菌门（相对丰度：PF：0.13%，PS：0.39%，MF：0.14%，MS：0.21%）在PS中被显著富集，表明芽单胞菌门更可能富集于贫营养土壤，并在土壤磷溶解中发挥重要作用。这一结果与本研究发现的PS中微生物生物碳含量最低（为22.67 mg kg⁻¹）这一结论相一致。（表S1）。以上结果可能进一步强调了连作对土壤养分减少的影响。

2. 根际土壤微生物之间的关系

微生物共现网络为微生物相互作用和群落结构提供了宝贵的见解，该方法不仅揭示了微生物群落的运作机制，而且揭示了维持生态系统的微妙平衡。本研究结果显示，与PF相比，PS的共现网络的边数量更少，这表明由于连续耕作，微生物稳定性可能降低。这种变化可能源于土壤养分变化，因为连续耕作可积累土壤化学物或消耗特定养分，从而对根际土壤微生物的稳定性产生连锁效应。混栽人工林中的微生物网络显示出平均路径长度和中介中心性显著低于单一种植的人工林。这种路径长度短且聚集性高的组合是小世界网络的一个特征标志，这一结论进一步得到了小世界倾向指数的充分支持。这种互联性充当了微生物网络间高效信息传输的通道，凸显了微生物在混合种植中关系错综复杂且适应性强的本质。这些发现凸显了混栽人工林中微生物关系的适应性特征。同时，为保障对网络拓扑结构研究结果的可靠性，研究者评估了结果对相关阈值选择敏感性的影响，并得出结论：当前网络具有较高的代表性。

3. 碳、氮、磷循环功能

微生物在碳、氮和磷循环中发挥着核心作用，这些循环对于植物生长和养分循环至关重要。碳、氮和磷循环对植物生长至关重要，并由微生物精细调控，这些微生物在土壤中执行这些元素的循环、转化和利用。本研究揭示了PS和PF中C、N和P基因结构之间存在显著差异，这表明连续种植改变了根际的元素循环。在第二代桉树人工林中，基因丰度的增加表明微生物正在通过补偿土壤中养分贫瘠来适应环境。这些发现可能与植物根际代谢有关，其中土壤营养匮乏会触发植物分泌有机化合物和激素，影响土壤微生物代谢途径的转化。

本研究还表明，在MS中，厌氧甲烷氧化和甲烷生成功能得到增强，这可能对甲烷排放产生影响，这是一个值得进一步研究的主题。有趣的是，在连续耕作的人工林中，有机磷的矿化作用更为显著。这可能是因为磷的缺乏刺激了与磷获取相关的基因表达，从而增强了植物利用环境中稀缺磷的能力。

4. 桉树根际土壤非靶向代谢组学

根际代谢物在调节植物与微生物的相互作用中起着关键作用，为深入理解土壤生态系统动态提供了宝贵的见解。尽管先前的研究表明根际代谢物影响微生物群落，但其确切作用仍不清楚。本研究结果表明，不同人工林代谢结构存在显著差异。相较于PS和MF，PF的根际土壤含有更多独有代谢物。其原因可能是纯种人工林缺乏生物多样性。本研究亦发现纯种人工林中的微生物多样性较低。连续种植可能导致颉颃性物质（如自毒化合物）的积累，从而抑制代谢多样性。然而，这种现象在PF中尚未发生。在混栽人工林土壤中，与核苷酸代谢途径相关的代谢物显著富集表明，微生物群落可能处于代谢活动更为活跃的状态，并具有更大的生长潜力。这为解释微生物生物量通常在此生境中较高的现象提供了潜在的代谢水平证据。这些研究结果支持了混合人工林中观测到的微生物多样性更高的现象。这种富集表明混合人工林根际土壤中的微生物繁殖和代谢作用增强，这也证实了我们在混合人工林中发现微生物多样性富集的结论。

5.代谢物、微生物群落与功能之间的联系

根际土壤中代谢物-微生物相互作用对土壤健康和植物生长至关重要。植物代谢产物可以选择性地促进特定的微生物群落，同时限制其他群落，塑造根际微生物群落。有趣的是，根际微生物对这些代谢产物进行反作用，影响代谢产物的生成和积累。本研究显示2,4-二氯-6-硝基酚和黄曲霉毒素B1的含量升高与微生物及功能组成呈正相关，这表明其与微生物功能存在潜在联系。尽管这些物质可能被视为潜在有害物质，但研究表明，即便是土壤中的有毒物质也可能具有促进微生物生长和代谢活动的潜力，从而引起微生物群落结构的变化。本研究聚焦于分子量小于1000Da的小分子代谢物，但未来研究应探讨蛋白质和生物大分子在塑造根际生态系统中的作用。理解大分子生物与微生物间的相互作用，可更深入地揭示桉树根际动态。然而，本研究存在局限性，亟需未来研究致力于解析根际中蛋白质、生物大分子与微生物间的关系，以更详尽地阐明桉树根际土壤微生态系统。