1. 动物取材：
- 颈椎脱臼处死8周龄C57BL/6小鼠，迅速截取远端结肠3–4 cm，冰PBS中纵向剖开。
2. 黏膜清洗：
- 用4 °C预冷PBS轻柔冲洗肠腔17–18次，直至上清无可见粪渣。
3. 隐窝松解：
- 将肠段剪成0.5 cm片段，置于2 mM EDTA-PBS（含10 mM HEPES）中，4 °C静置30 min。
4. 机械脱落：
- 弃EDTA，加冰PBS剧烈振荡30 s，重复3次；收集含隐窝悬液，经70 μm细胞筛过滤。
5. 纯化富集：
- 滤液300 g、3 min、4 °C离心，弃上清；沉淀重悬后100 g、3 min离心去除单细胞与碎片。
6. 计数与混胶：
- 取10 μL悬液镜检计数，调整密度至500 crypts/40 μL；与等体积Growth Factor Reduced Matrigel轻柔混匀。
7. 滴胶固化：
- 将40 μL混合液滴于24孔板中央，37 °C孵育10 min使Matrigel完全聚合。
8. 培养维持：
- 每孔沿壁缓慢加入400 μL IntestiCult™ Organoid Growth Medium（含1 % P/S），37 °C、5 % CO₂静置培养。
9. 常规换液：
- 每3–4 d全量更换新鲜培养基，第5–6天（第二传代后）可见囊泡-出芽状类器官，用于后续Aβ42干预及染色分析。
