研究背景与目的
纤溶酶原（PLG）是病原入侵的重要受体，在猪肺炎支原体、猪链球菌等猪病原体感染中发挥关键作用。然而目前尚无商品化猪纤溶酶原（sPLG）可供研究使用，现有研究多依赖价格高昂的人纤溶酶原（hPLG）。本研究旨在建立从猪血中高效提纯sPLG的方法，同时利用大肠杆菌重组表达猪组织型纤溶酶原激活剂（st-PA）和葡激酶（SAK），并通过多维度功能试验验证所制备蛋白的活性，为猪病原入侵机制研究及潜在的人用溶栓药物开发提供原材料。
1 材料与方法
1.1 试验材料
猪全血；SAK和st-PA基因序列连接至pET-21a载体；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、IPTG等试剂。
1.2 sPLG的提取与纯化
新鲜猪全血500 mL加抗凝剂，3 000×g离心10 min获得血浆；血浆加2倍体积PBS和蛋白酶抑制剂PMSF，10 000×g离心30 min去除杂质；0.22 μm滤器过滤后与Lysine亲和层析柱孵育2~3 h，PBS洗脱杂蛋白，50 mmol·L⁻¹ 6-ACA洗脱目标蛋白；收集蛋白经Superdex 200凝胶过滤层析进一步纯化，结合蛋白峰位置和SDS-PAGE结果收集精纯sPLG。
1.3 SAK的蛋白表达与纯化
SAK/pET-21a转化BL21(DE3)，0.4 mmol·L⁻¹ IPTG 18 °C诱导；菌体超声破碎后镍柱亲和层析，20~500 mmol·L⁻¹咪唑梯度洗脱，收集100和250 mmol·L⁻¹组分；Superdex 200凝胶过滤层析纯化，17 mL处单峰即为目的蛋白。
1.4 st-PA的蛋白表达、包涵体提取和复性
st-PA/pET-21a转化BL21(DE3)，1 mmol·L⁻¹ IPTG 37 °C诱导；超声破碎后收集沉淀，洗涤缓冲液纯化包涵体，6 mol·L⁻¹盐酸胍溶解；4 °C滴入复性液稀释复性8 h，PBS透析8 h（每2 h换液），获可溶活性蛋白。
1.5 sPLG的激活试验
96孔板设置sPLG±Eno/Casein±st-PA/SAK组合；37°C预孵1h，加激活剂孵育15min，加入纤溶酶特异性底物D-Val-Leu-Lys-pNA；15~90min测定OD₄₀₅ₙₘ，检测纤溶酶生成活性。
1.6 SAK、st-PA激活sPLG后降解纤连蛋白（Fn）
6组反应体系：Fn、sPLG、SAK、st-PA、sPLG+SAK、sPLG+st-PA；37 °C孵育3h，SDS-PAGE检测蛋白降解情况。
1.7 sPLG体外溶解猪血凝块
猪血凝块切成5 mm³颗粒，PBS清洗后分6组：sPLG+SAK、sPLG+st-PA、PBS、sPLG、SAK、st-PA；37 °C反应，1、2、6 h观察血凝块状态及尺寸变化。
2 结果
2.1 从猪血中提取、纯化sPLG
Lysine亲和层析6-ACA洗脱蛋白SDS-PAGE显示，70~95 ku间单一条带；分子筛层析14.5 mL处出现单峰，提示sPLG以单体形式存在且仅有一种糖基化修饰；500 mL猪血可获得粗纯sPLG约90 mg，精纯sPLG 50 mg，收率显著高于传统方法（图1）。
2.2 SAK的表达、纯化
SAK以可溶形式表达于上清；镍柱亲和层析100和250 mmol·L⁻¹咪唑洗脱蛋白量多且纯度好；分子筛层析17 mL处出现对称单峰，获得高纯度SAK（图2）。
2.3 st-PA的蛋白表达、包涵体复性和纯化
st-PA主要以包涵体形式存在于沉淀；包涵体提取纯化后40ku处条带单一、杂带少；稀释复性后PBS透析，可溶组分SDS-PAGE显示40 ku处明显目的条带，证实包涵体有效折叠为可溶活性蛋白（图3）。
2.4 sPLG的激活试验
st-PA和SAK均能有效激活sPLG，生成纤溶酶降解特异性底物；st-PA激活作用15~90 min持续增加，90 min接近最大值；SAK激活更迅速，30 min即达平台期；缺乏激活剂时，即使存在Eno或Casein，sPLG几乎不被激活，证实Eno/Casein仅为引发剂，st-PA/SAK为必需激活剂（图4）。
2.5 sPLG被SAK、st-PA激活后降解纤连蛋白（Fn）
sPLG+SAK/st-PA组在220~130 ku间出现多条降解条带，55 ku处出现新条带；单独sPLG、SAK、st-PA组Fn无降解，证实sPLG被激活后具备纤溶酶活性，可降解纤维蛋白（图5）。
2.6 sPLG体外溶解猪血凝块试验
sPLG+SAK/st-PA组2h后血凝块明显溶解，6 h后3块血凝块仅剩1~2 mm³，溶液呈鲜红色（红细胞释放）；st-PA组溶解效果优于SAK组；对照组及单独sPLG组血凝块无变化；单独SAK/st-PA组溶液略红（激活残留sPLG），但血凝块大小变化不显著（图6）。
3 讨论
本研究建立的Lysine亲和层析串联分子筛层析法，从250 mL猪血浆可获得精纯sPLG 50mg，纯化效率和收率较传统方法（340 mL人血浆获30 mg）显著提高。sPLG分子筛呈单峰，与人纤溶酶原双峰（两种糖基化形式）不同，推测sPLG仅有一种糖基化类型，体现物种差异。
首次实现st-PA的原核表达及包涵体复性，解决了猪t-PA无表达纯化方法、研究依赖人t-PA替代的问题。SAK以可溶形式表达，st-PA以包涵体形式表达，经稀释复性后均获活性。
功能验证证实sPLG-st-PA/SAK系统具备完整纤溶活性：激活试验显示剂量-时间依赖性底物降解；Fn降解试验证实蛋白酶活性；血凝块溶解试验模拟生理溶栓过程。st-PA溶栓效果优于SAK，与激活动力学特征一致。
猪源纤溶酶原系统具有人用潜力：猪与人PLG氨基酸序列一致性99.38%，t-PA一致性87.30%，结构高度相似；猪作为器官移植供体和血栓模型动物已获认可；sPLG生产成本远低于人源产品，为开发人用溶栓药物提供经济可行的原材料来源。
4 结论
本研究成功建立从猪血中高效提取纯化sPLG的方法（250 mL血浆获50 mg精纯蛋白），建立大肠杆菌表达重组st-PA和SAK并进行纯化的方法；sPLG激活试验、Fn降解试验及血凝块溶解试验均证实所制备sPLG具备完整纤溶酶原活性。该研究为猪源性病原与纤溶酶原互作机制研究提供关键材料，同时为开发人用猪源纤溶酶原溶栓药物奠定基础。
关键词：纤溶酶原 ; 组织型纤溶酶原激活剂 ; 葡激酶 ; 血栓 ; 蛋白纯化
