在现代农业生物育种技术领域，基因编辑技术被誉为“生命科学的剪刀”。其中，腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）因其能实现精准的A-to-G的单碱基替换且不产生DNA双断裂，成为作物遗传改良的重要工具。然而，由于其核心元件TadA8e的超高活性，面临高水平的sgRNA依赖及非依赖性“脱靶”风险，限制了其在育种中的广泛应用。近日，南京农业大学万建民院士团队在国际权威学术期刊《Plant Biotechnology Journal》上发表了题为“Cas9-Embedding Hyperactive TadA8e Confers Efficient and Highly Specific A-To-G Base Editing in Rice”的研究成果。团队通过蛋白质工程设计，系统开发了一类高效、高特异性的“嵌合高保真Cas9蛋白”形式的腺嘌呤碱基编辑器CH-ABE及其PAM-less变体，在水稻中实现了低脱靶、高效率的精准单碱基编辑。该工具成功应用于抗除草剂水稻品种的精准创制（通过安装OsALS-K591E突变），并能在不误伤旁系同源基因的情况下精准编辑改良株型及产量相关基因OsSPL14，显著提升了作物精准育种的安全性与效率。图1 高效高特异性腺嘌呤碱基编辑器CH-ABEs的开发
研究团队首先采用了“嵌入式”策略，将超活性的TadA8e蛋白“锁”在Cas9蛋白的特定柔性区域，利用空间位阻效应抑制其随机脱靶，最终筛选出最佳的嵌合兼容位点V583、I1050、I1072、S1248，开发出4个CP-ABE版本。在水稻内源性靶位点的综合靶向编辑活性效率达19.8%，且sgRNA非依赖脱靶编辑降低了8.3-55.3倍（图1）。图2 CH-ABEs系统在水稻中的脱靶分析
在此基础上，进一步筛选并引入高保真Cas9蛋白（SniperCas9、eSpCas9(1.1)和Sniper2L），构建了CH-ABE编辑系统，在水稻原生质体以及水稻再生植株中表现出强大的编辑能力（51.9%-86.7%），其中纯合和双等位突变效率22.0%-72.4%。同时显著降低sgRNA依赖以及sgRNA非依赖的脱靶编辑（最高降低达79.4倍），并通过全基因组和转录组测序分析进一步证明了其在编辑效率与安全性的协同优化（图2）。
图3 CP-ABE8e-RYs靶向范围拓宽的编辑工具的开发
为了克服传统编辑器对PAM序列（NGG）的严格依赖，研究团队进一步基于蛋白结构的定向进化策略，获得了SpRY-KK、SpRY-K1和SpRY-K2等高效的PAM-less变体。这些变体在非经典PAM靶位点上的编辑活性提升至原始SpRY的3.4-5.3倍。基于上述高活性PAM-less变体，研究人员构建了CP-ABE8e-RY编辑系统，成功将编辑器的靶向范围拓展至近乎“无PAM”限制的全基因组区域，并在非经典PAM位点上的整体编辑效率较原始SpRY提升了80.0%（图3）。图4 CP-ABE8e-RYKK在水稻精准改良中的应用
该新型嵌合碱基编辑系统在育种应用中展现出突出的精准改良潜力，能够在保持较高编辑效率的同时，有效区分序列高度相似的同源位点。研究团队以水稻重要株型产量调控基因OsSPL14（IPA1）为靶标，该基因与调节籽粒品质的OsSPL16（GW8）均受OsmiR156的转录后调控。但是，两者在OsmiR156结合位点处的20bp序列完全一致，且在8号染色体上物理距离极近，常规编辑工具极易引发旁系同源位点的误编辑，产生不良性状的连锁累赘。而本研究开发的CP-ABE8e-RYKK能够精准改造OsSPL14靶点，有效规避OsSPL16处的脱靶编辑，为特异性编辑工具在作物定向改良中的使用提供了范例。此外，该系统还成功在水稻乙酰乳酸合酶基因OsALS上精准创制常规碱基编辑工具难以实现的K591E突变，创制出具有抗除草剂性能的水稻新种质（图4）。CH-ABEs工具成功实现了水稻关键功能基因的精准单碱基改造，并创制了具有明确表型优势的突变材料，验证了该技术在育种改良和功能等位变异创制中的实际应用价值，为特异性编辑工具在作物定向改良中的使用提供了范例。该体系为作物分子设计育种提供了更加安全、可控且高效的技术支撑。南京农业大学在读博士生胡健健、李雪和已毕业硕士生高渝鸿为本文共同第一作者，万建民院士和李超教授为共同通讯作者。南京农业大学董小鸥教授、吴玉峰教授、王益华教授、赵志刚教授和刘世家研究员等也参与了部分研究工作。该研究得到国家生物育种重大专项、国家重点研发计划、生物育种钟山实验室和南京农业大学三亚研究院引导项目等资助。感谢齐禾生科高强博士在脱靶分析方面给予的技术指导。原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70511
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