1 引言

南京盐水鸭（Nanjing water-boiled salted duck，NWSD）是一种我国传统的低温禽肉制品，与北京烤鸭齐名，享誉全球。在酱卤肉制品中，其以质地柔嫩、香气浓郁、风味独特而备受推崇。其制作采用干腌与湿腌工艺，这些工序最终导致其含盐量较高。盐不仅能增强风味，还能通过调控脂质氧化、微生物活动及蛋白质降解来延长保质期、改善质地与色泽。然而，过量摄入盐分会增加中风、糖尿病、高血压及心血管疾病的风险。为解决这一问题，世界卫生组织设定了到2025年将全球钠摄入量降低30%的目标。同样，《“健康中国2030”规划纲要》也旨在到2030年将人均每日食盐摄入量降低20%。这些倡议凸显了开发有效减盐技术的迫切性。

目前已有多种策略被探索，包括改变盐的物理形态、使用非钠替代物替代钠以及采用先进加工技术。然而，由于成本高、风味不佳及制备复杂，这些方法的实际应用仍然有限。气味诱导的咸味增强（odor-induced saltiness enhancement，OISE）近年来成为一种颇具前景的策略，它通过鼻前和鼻后途径增强咸味感知。与鼻前感知相比，大量研究证据表明，鼻后途径通过激活与味觉相关的大脑区域，驱动嗅觉与味觉刺激之间的跨模态交互作用，从而在OISE中发挥更为关键的作用。然而，NWSD中是否存在能够诱导咸味增强的香气化合物，目前仍不清楚。

气味诱导的味觉增强始于嗅觉受体对香气化合物的识别，这是气味感知的基础。OR2W1是一种广谱嗅觉受体，可与多种食品来源的香气化合物结合。例如，焦糖样气味剂能与OR2W1中的Asn155和Tyr260等残基形成高亲和力键。更重要的是，这些香气化合物还可能通过与味觉受体的相互作用来增强味觉感知。跨膜通道样蛋白4（Transmembrane channel-like protein 4，TMC4）被确认为TMC家族中首个阴离子/氯离子通道受体，在咸味感知中发挥着关键作用。因此，以OR2W1和TMC4为受体靶点，并利用分子对接和分子动力学（molecular dynamics，MD）等计算方法，可以阐明NWSD中香气化合物的结合机制，为咸味增强的分子基础提供见解，并指导低盐肉制品的开发。目前，分子对接和分子动力学已被证明是研究气味剂与嗅觉或味觉受体之间相互作用的有效工具。

因此，南京农业大学食品科学技术学院Hou Jinxue等采用多阶段多模态方法，探究NWSD中OISE的机制：（1）监测鼻后香气特征及其释放规律；（2）鉴定具有咸味增强作用的香气化合物并验证其咸味增强能力；（3）利用分子对接和分子动力学，研究所选香气化合物与OR2W1/TMC4受体的结合相互作用，从而揭示其跨模态增强机制，并证实其在咸味感知中的作用。

图形摘要

2 结果与讨论

2.1 鼻后途径香气化合物分析

在NWSD中，共鉴定出30 种香气化合物，包括9 种醛类、13 种醇类、1 种酮类、4 种烃类及3 种其他化合物。通过热图（图1A）对其分布进行可视化，以便比较鼻后香气特征。醛类是主要类别，赋予青草和脂肪风味，是肉香的关键贡献者。检测到的醛类主要为直链醛，如戊醛、己醛、辛醛和壬醛，主要来源于脂质降解与氧化。其中，己醛在整个咀嚼过程中含量最为丰富，具有青草和脂肪气息。这一结果与相关研究一致，即己醛来源于ω-6不饱和脂肪酸，是鸭肉中的主要醛类，可能在鼻后香气感知中发挥重要作用。其他直链醛，包括戊醛、壬醛、庚醛和辛醛，在各咀嚼阶段均被持续检测到，这些化合物也常见于其他鸭肉制品中，如麻辣鸭、烤鸭和酱鸭。这些醛类在所有咀嚼阶段均存在，表明它们是整体香气感知的重要贡献者。

图1 鼻后通路NWSD中香气化合物的热图（A）、基于气味活性值的桑基图（B）

醇类是第二大类化合物，主要来源于脂质氧化。与饱和醇相比，不饱和醇因其较低的阈值通常具有更强的感官效应。1-辛烯-3-醇具有强烈的蘑菇样香气和低气味阈值，在咀嚼过程中持续被检测到，使其成为鸭肉制品的特征性化合物。其持续存在可能增强消费者对盐水鸭的偏好。值得注意的是，支链酮类如2-甲基-3-辛酮，因其甜美的花香和果香，也对肉香风味有所贡献。该化合物通常通过支链脂肪酸的氧化形成。尽管在样品中检测到了烃类化合物，如2,6,7-三甲基癸烷和2,6,10-三甲基十四烷，但它们对NWSD整体香气特征的直接贡献被认为可忽略不计。这一现象归因于它们的高分子质量、高度饱和结构及支链结构，导致其气味阈值极高。然而，作为脂质氧化的稳定终产物，这些化合物为原料特性及加工条件提供了重要信息。其他化合物，如同样源自脂质氧化的2-戊基呋喃，赋予青草、果香和脂肪气息。这些挥发性物质可能进一步调节NWSD的香气，在口腔感知研究中值得关注。

采用气味活性值（odor activity values，OAV）方法鉴定香气的主要贡献者。OAV＞1的化合物被视为活性贡献者。OAV的计算结果显示，有10 种化合物超过该阈值。其中，己醛、辛醛和壬醛的OAV＞30，己醛的数值最高。己醛、庚醛、壬醛、癸醛和1-辛烯-3-醇在咀嚼过程中OAV始终保持在1以上。这些化合物被认为是鸭肉香气的关键成分，其动态释放模式可能在消费过程中对风味感知的调节起核心作用。

图2 鼻后通路对NWSD的动态香气感知

2.2 NWSD鼻后途径的香气感知

NWSD 4 种香气属性的时间-强度（temporal dominance of sensations，TDS）曲线如图2所示。偶然性阈值和显著性阈值分别为0.250和0.346。低于偶然性阈值的属性被认为对整体感知贡献极小，而高于显著性阈值的属性则被视为主导属性。TDS结果表明，NWSD的香气感知在咀嚼过程中呈动态变化。肉香和咸鲜是主要属性，其主导率均超过2 个阈值。这些香气在整个咀嚼过程中持续存在，证实了它们对鼻后感知的重要贡献（P＜0.05）。肉香在咀嚼初期15 s内占主导地位，而咸鲜在15～30 s之间逐渐成为主导。相比之下，土腥味和脂肪味属性始终低于偶然性阈值，表明它们对整体香气感知的影响极小。综上所述，肉香和咸鲜被确定为NWSD的主导鼻后香气，并表现出明显的时间特征。这些发现揭示了口腔加工过程中香气释放的动态特性。

2.3 NWSD鼻后途径中Na⁺和K⁺的含量

图3展示了不同咀嚼阶段，咀嚼后的NWSD及唾液中Na⁺和K⁺含量的变化。在0 s时，咀嚼后鸭肉中2 种离子的含量均达到峰值。随着咀嚼的进行，咀嚼样品中的离子含量总体下降，而唾液中的离子含量则增加。这种反向关系表明，肉基质中的初始离子含量与其向唾液中的迁移密切相关，持续的溶解与转运有助于增强咸味感知。

图3 经鼻后通路的NWSD中Na⁺和K⁺含量变化

进一步分析表明，离子释放主要集中在咀嚼早期阶段（0～15 s），之后释放速率趋于稳定。这一发现与TDS感官评价结果一致。Na⁺的释放趋势也与相关研究结果相符，即初始24 s内快速释放，随后在24～30 s进入饱和阶段。释放的初始爆发可能归因于肉表面或间隙中的游离Na⁺，其在接触唾液后迅速扩散。随着咀嚼的进行，组织破碎破坏了肉质结构，直至达到极限。在此之后，离子释放受到唾液蛋白和酶以及口腔黏膜缓冲能力的影响，从而维持咸味的平衡感知。

2.4 香气化合物与Na⁺/K⁺含量及TDS数据的相关性分析

如图4A所示，8 种醛类和1 种呋喃类化合物与咀嚼样品中Na⁺含量呈高度正相关（R＞0.8，P＜0.05）。这些化合物包括戊醛、己醛、庚醛、辛醛、(Z)-2-癸烯醛、癸醛、十二醛、十四醛和2-戊基呋喃。上述9 种化合物以及壬醛，与咀嚼鸭肉中K⁺含量也呈正相关（R＞0.8，P＜0.05）。相比之下，这10 种化合物与唾液中的Na⁺和K⁺呈负相关（P＜−0.75）。这些趋势表明，咀嚼过程中香气化合物的扩散可能受到唾液-受体界面处离子含量变化的影响。随着咀嚼的进行，离子迁移至唾液中，这改变了香气化合物在食品基质中的结合强度，并促进其释放。综上所述，推测离子-香气相互作用可能影响挥发性物质的释放动态，从而调节NWSD的咸味感知。

图4 NWSD中Na⁺/K⁺与香气化合物的Pearson相关性网络图（A）；感官评价结果与香气化合物的相关性分析（B）；OAV＞1、Na⁺/K⁺及咸鲜感官相关的香气化合物Venn图（C）；用于气味诱导咸味增强评价的香气化合物筛选结果（D）

如图4B所示，27 种香气化合物与感官属性（咸鲜、肉香、土腥味和脂肪味）相关（|R|＞0.7，P＜0.05）。其中，戊醛、己醛、庚醛、辛醛和2-戊基呋喃与咸鲜属性呈正相关（R＞0.7，P＜0.05），这与它们与Na⁺和K⁺呈正相关的结果一致。类似的研究在腊肉中也有报道，其中二甲基二硫醚、2,5-二甲基噻吩和2,5-二甲基吡嗪等化合物与咸鲜属性密切相关，并被证明能增强咸味感知。具有与咸味相协调的香气特征的食物，如培根、奶酪和沙丁鱼，也表现出类似的效果。因此，本研究中鉴定出的与咸鲜属性相关的香气化合物，可能同样有助于增强NWSD的咸味。值得注意的是，这些与咸鲜相关的化合物与土腥味属性也呈正相关（R＞0.7，P＜0.05）。相反，几种醇类化合物，包括1-辛烯-3-醇、1-己醇、1-庚醇和2-癸烯-1-醇，与肉香味呈负相关（R＜−0.8，P＜0.05）。

表1 与咸味增强相关的香气化合物及其初始含量

2.5 NWSD中具有OISE效应的香气化合物筛选与评价

根据以下三个标准筛选具有潜在OISE效应的香气化合物：（1）通过鼻后途径感知且与Na⁺和K⁺呈强相关性（|R|＞0.7）的化合物；（2）与咸鲜属性高度相关（R＞0.7）的鼻后化合物；（3）在NWSD咀嚼过程中OAV＞1的化合物，这些化合物通常被视为风味感知的关键贡献者。依据上述标准，筛选出5 种代表性化合物（包括4 种醛类和1 种呋喃类），用于进一步评价其OISE效应（图4C、D）。通过预实验确定合适含量（表1），并制备梯度稀释液，以评估其在不同NaCl水平下的咸味增强潜力。

将5 种化合物以不同含量添加至NaCl溶液中，采用鼻后嗅觉方法评价其对咸味感知的影响，并计算各化合物的OISE值（图5A）。与0%和0.75% NaCl溶液相比，OISE效应在0.25%和0.5%含量下更为显著，其中在0.5%时增强作用最强，表明OISE效率依赖于NaCl含量。这一结果与相关研究一致，即从麻辣鸭中分离的香气化合物在0.2%和0.5% NaCl条件下能显著增强咸味感知。类似地，有研究报道干腌火腿中的1-辛烯-3-醇和2-甲基丁醛在0.3% NaCl时表现出最强的增强效应。这一现象可通过刺激-响应函数的上升阶段来解释：在较低NaCl含量下，盐度的微小增加更易被感知，从而产生更强的OISE效率。

除0% NaCl溶液外，其余五种化合物在所有测试的NaCl含量下均显著增强了咸味感知（P＜0.05），证实了与咸味相关的香气化合物能够放大咸味。其中，庚醛的增强效应最强，其次是辛醛、己醛、戊醛和2-戊基呋喃。具有脂肪和青草气味的庚醛表现出最高的OISE值，为0.96（P＜0.001），而具有青豆和奶油香气的2-戊基呋喃最大OISE值仅为0.33（P＜0.001），显著低于庚醛。以往研究表明，脂肪味、肉味等风味描述词与咸味感知密切相关。因此，醛类化合物似乎比呋喃类化合物具有更强的咸味增强作用，表明其作为食品减盐策略中目标气味剂的潜力。

含量依赖性效应也很明显。如图5B所示，庚醛和辛醛在9.375～500.000 μg/L范围内表现出最强的OISE效应，其次是己醛（5.000～250.000 μg/L）。这些发现与图5A中观察到的趋势一致，进一步证实了庚醛和辛醛作为有效咸味增强剂的作用。值得注意的是，庚醛在低至9.375 μg/L的含量下即表现出OISE活性，远低于先前报道的阈值。同样，辛醛的最低有效含量（9.375 μg/L）也低于0.3% NaCl条件下报道的水平。这一现象可通过联想学习来解释，即大脑将气味和咸味整合为统一的感知。当气味与咸味一致时，即使含量极低，先前的感官经验也可能增强大脑将这些气味与咸味关联的倾向。另一种可能的解释是，与较高含量相比，低含量气味剂不太可能通过转移嗅觉注意力来掩盖内在咸味或降低咸味感知。综上所述，这些研究结果表明，庚醛和辛醛在低含量下是有效的咸味增强剂。这为优化低盐鸭肉制品中的香气-盐相互作用提供了有价值的指导，并为不同应用场景下低盐食品的设计提供了更广泛的参考。

A.通过鼻后途径评价的香气化合物在NaCl溶液含量为0%、0.25%、0.50%、0.75%条件下的表现；B.在固定NaCl含量下，通过鼻后途径评价的不同含量香气化合物的表现。*表示差异显著，0.01＜P≤0.05；**表示差异极显著，0.001＜P≤0.01；***表示差异高度显著，P≤0.001。

图5 气味诱导OISE结果

2.6 咸味增强香气与嗅觉及味觉受体的分子对接分析

通过计算对接，研究NWSD中咸味增强香气化合物与嗅觉/味觉受体之间的潜在相互作用，从而为OISE的分子机制提供见解。将5 种代表性化合物分别与OR2W1和TMC4受体进行对接，并计算其对接能。OR2W1的对接能范围为−5.2～−3.8 kcal/mol，TMC4的对接能范围为−5.6～−3.8 kcal/mol，所有数值均低于0，表明具有良好的结合亲和力及调节咸味感知的潜力。

如图6所示，二维和三维结构图展示了化合物与受体之间的相互作用网络。在OR2W1-气味剂复合物中，疏水相互作用占主导地位，关键残基包括TYR259、ILE255、PRO138、PHE61、VAL207和ILE206。其中，TYR259已被确定为一个关键结合位点。配体的芳香环结构有助于与受体残基形成π-π堆积，从而稳定配体-受体结合。除疏水接触外，在OR2W1-己醛、OR2W1-庚醛和OR2W1-辛醛复合物中还观察到氢键，残基THR57和ARG64参与了这些相互作用。推测这些相互作用与疏水作用协同增强气味感知。TMC4受体包含16 个活性结合残基，包括PRO386、LYS389、THR222、PHE225、ASN393、LEU390和ASN226。其中，ASN、THR和PRO残基通过形成氢键和疏水相互作用发挥关键作用。值得注意的是，ASN是一个主要的活性位点，可通过其酰胺基与气味化合物的羟基或羰基形成氢键。综上所述，疏水相互作用和氢键被确定为稳定OR2W1和TMC4受体-气味剂复合物的主要驱动力。这些发现提示了可能有助于OISE的分子相互作用。然而，香气化合物仍可能在嗅觉和味觉受体水平上发挥竞争性或协同性作用。目前对此类机制的认知有限，需要进一步研究以阐明OISE背后的分子相互作用。

图6 戊醛（1）、己醛（2）、庚醛（3）、辛醛（4）和2-戊基呋喃（5）与OR2W1（A）及TMC4（B）的相互作用

2.7 咸味增强香气与嗅觉及味觉受体的MD分析

为进一步探究配体-受体相互作用过程中的构象变化，选取OISE效应最强的2 种化合物庚醛和辛醛，分别与OR2W1和TMC4进行100 ns的MD模拟（图7）。

首先通过均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）评估复合物的稳定性。TMC4-庚醛和TMC4-辛醛的RMSD值始终保持在1.75 nm以下，而OR2W1-庚醛和OR2W1-辛醛的RMSD值在0.75 nm平均值附近波动，无显著偏差，表明结构构象稳定（图7A）。随后采用均方根波动（root means square fluctuation，RMSF）分析评估氨基酸残基的柔性，较低的值反映较高的结构稳定性。如图7B所示，所有复合物的波动均低于1.0 nm，表明整体结构稳定。部分残基出现局部波动，可能归因于与周围分子的相互作用。

计算回旋半径（the radius of gyration，Rg）值以评估结构致密性，较低的Rg值表示蛋白质构象更紧凑。如图7C所示，模拟过程中TMC4复合物的Rg值逐渐降低，表明疏水接触增加，从而稳定了受体-配体相互作用。相比之下，OR2W1复合物的Rg值保持稳定，反映出构象密度一致且内聚力强。溶剂可及表面积（solvent accessible surface area，SASA）分析进一步支持了这些结果（图7D）。TMC4复合物的SASA曲线呈下降趋势，表明疏水残基逐渐包埋入蛋白质核心，而亲水残基仍暴露于溶剂中。OR2W1复合物的SASA值保持稳定，印证了其结构稳健性。

基于RMSD和Rg值构建了自由能景观图（图7E、H）。每个复合物均呈现单一能量最小值，证实了稳定的结合构象。值得注意的是，TMC4-辛醛复合物表现出最低的吉布斯自由能，表明其热力学稳定性最高（图7H）。

A. RMSD；B. RMSF；C. Rg；D. SASA；E～H.复合物的吉布斯自由能景观图。

图7 庚醛/辛醛与OR2W1/TMC4在100 ns分子动力学模拟中的相互作用结果

综上所述，MD模拟结果表明，通过RMSD、RMSF、Rg、SASA及能量景观分析证实，所有4 个受体-配体复合物均保持稳定构象。庚醛和辛醛与OR2W1及TMC4的强预测亲和力，为其与咸味增强的关联提供了潜在的分子基础。

3 结论

本研究探究了NWSD香气化合物的鼻后释放规律及其与Na⁺和K⁺动态变化之间的关系。结果表明，在咀嚼初期（0～15 s），肉香是主导感官属性，随后（15～30 s）咸鲜成为主导。咀嚼残留物中Na⁺和K⁺含量逐渐降低，而其在唾液中的含量升高，表明咀嚼过程中离子持续迁移。在通过GC–MS鉴定出的30 种香气化合物中，有5 种化合物（戊醛、己醛、庚醛、辛醛和2-戊基呋喃）能显著增强NaCl溶液的咸味感知（P＜0.05）。它们的咸味增强效应取决于化合物含量和NaCl含量，在0.5% NaCl时观察到的效应最强。值得注意的是，即使在极低含量下，咸味感知也能得到增强。分子对接和动力学模拟进一步预测，这些化合物与OR2W1和TMC4受体的相互作用主要由氢键和疏水相互作用介导，为其与咸味增强的潜在关联提供了机制性线索。总体而言，这些研究结果表明，所选香气化合物能够调节咸味感知，并可作为肉制品减盐的有效气味剂。需要指出的是，本研究提出的OR2W1和TMC4受体参与作用主要基于计算模型。为进一步阐明OISE的内在机制，未来计划通过细胞或动物模型中的OR2W1基因敲除和TMC4通道抑制等方法，对这些靶点进行验证。