南京大学王炜、薛斌、曹毅《‌‌AM》|机械诱导自适应自生长蛋白水凝胶

活体组织在反复机械载荷作用下会增强强度，然而在合成材料中实现类似的自适应生长仍是一项艰巨挑战。本文报道了一种基于蛋白质的水凝胶，该材料能够通过机械化学诱导实现自我生长，并在受力状态下自主增强其基础机械性能。该策略利用铜储存蛋白Csp1：其受力调控的结构解折叠会释放Cu(I)，后者可催化原位叠氮-炔烃环加成反应，在机械载荷下形成次级交联；当载荷解除后，Csp1重新折叠并重新捕获Cu(I)，终止催化反应并恢复生长能力。这种机械催化反馈回路可在封闭系统中实现应力和时间依赖性的自我强化，且无需外部单体供应。通过利用Cu(I)稳态在循环生长-暂停-生长过程中的动态变化，该水凝胶展现出可编程的机械记忆特性。通过将力依赖性蛋白质构象动力学与催化活性相结合，该策略建立了一个可普适化的机械化学框架，用于设计结构和功能在机械刺激下动态演变的自适应生物材料。

图1 机械诱导自适应自生长蛋白水凝胶的设计。(a) 传统力响应自生长水凝胶的示意图。新型聚合物网络在聚合反应启动后形成，并独立于机械输入（插图：应变输入）持续发展。由于初级网络断裂和自由基释放，机械性能（包括杨氏模量和最大应力）最初会下降，随后随着新共价网络的形成而提升。(b) 自适应力响应自生长水凝胶的示意图及相应的输入应变信号（插图）。交联仅在机械加载期间发生，并在松弛时立即停止，从而实现应变依赖性且可编程的网络发育。(c) 铜储存蛋白水凝胶中机械诱导自适应自生长的机制：机械变形使Csp1蛋白展开并释放Cu(I)离子，这些离子催化网络中预载的叠氮/炔烃单体发生共价交联；松弛时，Csp1重新折叠并重新捕获Cu(I)离子，从而停止进一步生长并防止不可逆的离子损失。(d) 水凝胶内力触发的蛋白质展开与重折叠过程示意图，该过程与Cu(I)催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）在机械诱导自适应自生长过程中协同进行。

图2 蛋白质解折叠介导的Cu(I)释放及重折叠介导的恢复过程的分子特征分析。(a) 基于原子力显微镜（AFM）的单分子力谱示意图。融合蛋白通过共价键固定于玻璃基底，并利用功能化AFM悬臂进行捕获。(b) 融合蛋白的代表性单分子力-伸长曲线。每个解折叠事件均采用蠕虫状链（WLC）模型进行拟合：轮廓长度增加峰值（ΔLc ≈42 nm）对应Csp1解折叠（红色箭头），随后出现五个GB1解折叠峰（蓝色箭头），末端峰值代表 Fgβ /SdrG复合物断裂（黑色箭头）。(c) Csp1解折叠力分布直方图（平均值：120 ± 43 pN）。(d) Csp1轮廓长度增量直方图（ΔLc = 42 ± 2.4 nm）。(e) 超声波触发并由疏水染料ANS检测的SC-Csp1-SC蛋白力诱导解折叠示意图。(f，g) ANS染色的SC-Csp1-SC溶液（1.25 mM）经超声处理（US）或加热（Heat）后的荧光图像(f)与荧光光谱(g)；未处理蛋白作为对照（Control）。(h) 通过双辛可宁酸（BCA）络合显色（生成紫色）观察到的SC-Csp1-SC蛋白在解折叠过程中（对照、超声、加热）Cu(I)释放的示意图（上）及图像（下）。(i) 与图(h)对应的紫外-可见吸收光谱。插图：Cu(I)释放量的定量分析（以Csp1中储存的总Cu(I)量的100%为基准进行标准化）。(j) 展示了蛋白质重折叠后Cu(I)离子恢复过程的示意图（上）及图像（下）。超声处理后（释放阶段），SC-Csp1-SC溶液分别静置0、5和10分钟；紫色颜色逐渐消退表明Csp1对Cu(I)进行了再摄取。(k) 以从Csp1释放的总Cu(I)量为100%基准，量化了超声处理后不同静置时间对应的Cu(I)恢复效率。图(i)和(k)中的数据以均值±标准差表示，n=3。

图3 Csp1交联水凝胶中机械诱导的Cu(I)离子释放与恢复。(a) 单网络铜储存蛋白水凝胶（PAAm/Csp1水凝胶）示意图。Csp1通过SpyCatcher-SpyTag连接及后续共聚反应作为共价交联剂。(b) 机械拉伸诱导的Cu(I)离子释放与恢复循环示意图及图像，通过BCA显色法观察。松弛过程促使蛋白质重新折叠并恢复Cu(I)离子浓度。(c) 四次拉伸-松弛循环中的代表性应力-时间曲线，插图显示放大后的松弛阶段。(d) PAAm/Csp1水凝胶从第一次到第四次拉伸-松弛循环的重叠应力-应变曲线。(e) 第一至第四循环的归一化最大应力与残余应变总结。数据以均值±标准差表示，n=3。(f) 不同拉伸应变（100%、200%、400%）下各循环次数的Cu(I)释放热图。拉伸时间=10分钟；CCsp1浓度=3 mM。(g) 不同Csp1浓度（1、2、3 mM）下各循环次数的Cu(I)释放热图。拉伸时间=10分钟；应变=400%。(h) 不同拉伸时长（0、5、10分钟）下各循环次数的Cu(I)释放热图。应变=400%；CCsp1浓度=3 mM。(i) 不同拉伸应变（100%、200%、400%）下各循环次数的Cu(I)恢复热图。拉伸时间 = 10 分钟；松弛时间 = 0 分钟；CCsp1 = 3 mM。   (j) 不同 Csp1 浓度（1、2、3 mM）下，不同循环次数时 Cu(I) 恢复情况的热图。拉伸时间 = 10 分钟；松弛时间 = 0 分钟；应变 = 400%。   (k) 不同松弛时长（0、5、10 分钟）下 Cu(I) 恢复效率的热图。应变 = 400%；拉伸时间 = 10 分钟；CCsp1 = 3 mM。

图4 机械触发的水凝胶时空自生长。(a) 负载叠氮基和炔基的Csp1交联水凝胶网络示意图（PAAm/Csp1/AA水凝胶）。(b) PAAm/Csp1/AA（蓝色）和PAAm/apo-Csp1/AA（黄色）水凝胶在重复拉伸-松弛循环过程中的应变-时间及力-时间曲线。顶部轨迹显示循环过程中施加的输入应变信号。(c) 含不同叠氮基/炔基浓度（3、6和9 mM）的PAAm/Csp1/AA水凝胶在16次拉伸-松弛循环前（虚线）和循环后（实线）的应力-应变曲线。拉伸时间与松弛时间分别固定为10分钟和0分钟；应变=400%。(d) PAAm/Csp1/AA水凝胶在不同拉伸时长（0、5和10分钟）下进行16次拉伸-松弛循环前（对照组）及循环后的应力-应变曲线。CAzide = CAlkyne = 9 mM；松弛时间=0分钟；应变=400%。(e) PAAm/Csp1/AA水凝胶在不同松弛时间（0、5和10分钟）下进行16次拉伸-松弛循环前（对照组）及循环后的应力-应变曲线。CAzide = CAlkyne = 9 mM；拉伸时间=0分钟；应变=400%。(f) PAAm/Csp1/AA水凝胶在不同应变（100%、200%和400%）下进行16次拉伸-松弛循环前（对照组）及循环后的应力-应变曲线。叠氮化物 = 烷炔 = 9 mM；拉伸时间 = 0分钟；弛豫时间 = 0分钟。 (g) 通过依次施加质量递增的重量（50、70和100克）在循环拉伸后，观察机械诱导的逐步自生长过程。 (h) 对应图(g)所示逐步加载-卸载行为的力-时间曲线。 (i) 机械光刻示意图：模具对水凝胶的局部压缩会选择性启动压缩区域内的CuAAC反应。 (j) 使用3-叠氮基-7-羟基香豆素（3AH）标记未反应叠氮基团后，图案化PAAm/Csp1/AA水凝胶的明场（上）与荧光（下）图像。比例尺（左、右）分别为2毫米和120 µm 。 (k) 图(j)所示压缩与未压缩区域通过原子力显微镜纳米压痕获得的杨氏模量直方图。

图5 机械触发Cu(I)催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）及次级交联形成的机理验证。(a) 由未折叠Csp1释放Cu(I)引发的CuAAC反应示意图。(b，c) 经拉伸-松弛循环后，从单网络PAAm/Csp1水凝胶中收集的浸出液的光学图像(b)和荧光光谱(c)，使用CuAAC启动探针3AH检测。比例尺：3毫米。(d–f) 不同拉伸-松弛循环后，PAAm/Csp1/AA水凝胶的反应机制示意图(d)、图像(e)及CuAAC反应效率(f)，均采用3AH测定。比例尺：10毫米。图f数据以平均值±标准差表示，n=3。(g) PAAm/Csp1/AA水凝胶在0、8和16次拉伸-松弛循环后的FT-IR光谱。(h) PAAm/Csp1/AA水凝胶经多次拉伸-松弛循环后的SEM图像（上）及对应的孔径分布（下）。比例尺：7 µm 。(i) PAAm/apo-Csp1/AA（左）和PAAm/Csp1/AA（右）水凝胶在300%应变下的双折射图像。比例尺：20毫米。(j) 图(i)中水凝胶的双折射强度随拉伸-松弛循环次数增加的定量变化曲线。