南京医科大学 | 慢性疼痛伴焦虑新靶点:神经元 BEST1 介导的紧张性兴奋

慢性疼痛全球患病率超 30%，约 40% 患者会合并焦虑，且焦虑常在疼痛缓解后仍持续，两者相互加重，临床治疗难度极大。腹内侧前额叶皮层（vmPFC）是调控疼痛感知与焦虑情绪的核心脑区，既往研究发现 vmPFC 的 AMPAR 突触传递增强与疼痛相关焦虑有关，但仅 AMPAR 转运不足以解释焦虑的延迟发生，提示存在其他关键调控机制。谷氨酸介导的紧张性兴奋可调控神经元兴奋性，而钙激活氯通道 BEST1 在脑内广泛表达，且能通透谷氨酸，参与脑卒中、癫痫等神经疾病，但神经元 BEST1 是否调控慢性疼痛相关焦虑，其作用机制尚未明确，亟需深入探究。

• 动物模型：采用雄性 / 雌性 C57BL/6 小鼠，建立坐骨神经分支损伤（SNI）、脊神经结扎（SNL）慢性神经病理性疼痛模型，设假手术组对照。

• 行为学检测：通过 Von Frey 纤维丝测机械痛阈、丙酮试验测冷痛敏；用高架十字迷宫（EPM）、新奇抑制摄食（NSF）、旷场、明暗箱、大理石掩埋试验评估焦虑样行为。

• 分子与细胞实验：Western blot 检测 vmPFC 区 BEST1、AMPAR 亚基（GluA1/GluA2）表达；免疫荧光定位 BEST1 细胞类型；微透析联合 UPLC-MS/MS 检测胞外谷氨酸、GABA 浓度。

• 电生理与光遗传：膜片钳记录神经元动作电位、mEPSCs、紧张性兴奋电流；光纤光度法检测神经元钙信号；AAV 病毒介导 BEST1 敲低 / 敲除、nNOS 敲除、突变 stargazin 表达；vmPFC 埋管注射 DHK、CTX、DIDS 等药物干预。

• 小鼠 SNI 后 14 天出现慢性疼痛但无焦虑，35 天起稳定出现焦虑样行为，vmPFC 区 AMPAR 膜转运 14 天已增强，且 14 天与 35 天无差异，证实 AMPAR 转运是焦虑必要非充分条件。

• 35 天焦虑小鼠 vmPFC 胞外谷氨酸浓度升至假手术组 6 倍，异常谷氨酸紧张性兴奋增强，且以 NMDAR 介导为主；激活 / 抑制谷氨酸转运体可双向调控焦虑，明确紧张性兴奋是焦虑关键。

• 35 天起 vmPFC 神经元（主要为兴奋性锥体细胞）BEST1 表达上调，通道通透性增强，介导谷氨酸释放，触发异常紧张性兴奋。

• 神经元 BEST1 敲除或药物抑制（DIDS），可阻断谷氨酸释放与紧张性兴奋，降低 AMPAR 突触传递，不缓解疼痛但显著减轻焦虑，且改善镇痛后持续焦虑。

Figure 1：慢性神经病理性疼痛诱导焦虑样行为的时间进程

该图通过 spared nerve injury（SNI）和 spinal nerve ligation（SNL）两种小鼠神经病理性疼痛模型，系统呈现了慢性疼痛与焦虑样行为出现的时间关联。结果显示，SNI 术后 7 天起小鼠即出现稳定的机械性痛觉过敏（von Frey 测试阈值显著降低），但焦虑样行为（高架十字迷宫 EPM、新奇抑制摄食 NSF 测试）仅在术后 28 天初步显现、35 天起稳定存在，且该行为持续至术后 56 天；SNL 模型也呈现完全一致的时间规律，同时排除了运动能力、基础摄食行为对焦虑测试结果的干扰，明确了慢性疼痛先于焦虑、焦虑在疼痛持续 3-5 周后稳定出现的时序特征，为后续选取术后 14 天（痛而无焦虑）、35 天（痛且伴焦虑）两个关键时间点开展机制研究提供了行为学依据。

Figure 2：SNI 诱导的焦虑样行为与 vmPFC 的 AMPAR 突触传递增强相关

该图聚焦腹内侧前额叶皮层（vmPFC）的 α- 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸受体（AMPAR）转运与突触功能，揭示 AMPAR 的关键作用及局限性。蛋白检测显示，SNI 术后 14 天和 35 天，vmPFC 突触膜上 AMPAR 核心亚基 GluA1、GluA2 的表达均显著升高，且两个时间点无差异，证明 AMPAR 向突触膜的转运在疼痛早期即已发生；通过敲除 nNOS、突变 stargazin 蛋白抑制 AMPAR 转运后，小鼠焦虑样行为显著缓解但疼痛未改善，证实AMPAR 转运是焦虑发生的必要条件；进一步电生理记录发现，术后 14 天神经元兴奋性、AMPAR 微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）仅幅度升高，而 35 天兴奋性显著增强、mEPSCs 幅度与频率均大幅上升，说明AMPAR 转运不足以单独引发焦虑，存在额外调控因素在疼痛后期进一步增强突触传递、触发焦虑。

Figure 3：SNI 后异常的紧张性兴奋介导焦虑样行为

该图围绕 vmPFC 的谷氨酸紧张性兴奋展开，阐明其在疼痛后期触发焦虑的核心作用。微量透析结合质谱分析显示，SNI 术后 35 天 vmPFC 胞外谷氨酸浓度升至假手术组的 6 倍，而 γ- 氨基丁酸（GABA）浓度无变化，伴随神经元谷氨酸紧张性兴奋电流显著增强，且该兴奋主要由 N - 甲基 - D - 天冬氨酸受体（NMDAR）介导；通过药物调控谷氨酸转运体 GLT-1，术后 14 天用抑制剂 DHK 升高胞外谷氨酸、增强紧张性兴奋，可直接诱导小鼠焦虑样行为，术后 35 天用激活剂 CTX 降低谷氨酸、抑制紧张性兴奋，能显著缓解焦虑且不影响疼痛，同时排除了突触前释放、突触数量变化的干扰，直接证明vmPFC 异常升高的谷氨酸紧张性兴奋是连接慢性疼痛与焦虑的关键中间环节，可独立调控焦虑样行为。

Figure 4：异常紧张性兴奋通过增强 AMPAR 突触传递诱导焦虑

该图通过体外电生理和体内给药实验，揭示谷氨酸紧张性兴奋与 AMPAR 突触传递的级联调控机制。体外实验先确定 0.2μM 谷氨酸可模拟 SNI 术后 35 天的紧张性兴奋水平，在此浓度下，vmPFC 神经元 AMPAR 介导的突触成功率、突触效能、mEPSCs 幅度与频率均显著升高，且该增强效应依赖突触后钙离子信号（钙离子螯合剂 BAPTA 可完全逆转）；体内实验中，对 SNI 术后 14 天小鼠持续微量灌注 0.2μM 谷氨酸，可成功诱导出焦虑样行为，而假手术组灌注相同剂量谷氨酸无焦虑表现，证实异常紧张性兴奋需以 AMPAR 转运为基础，通过钙离子依赖途径进一步放大 AMPAR 突触传递，二者协同作用最终触发慢性疼痛相关焦虑，单独的紧张性兴奋或 AMPAR 转运均无法诱导焦虑。

Figure 5：神经元 BEST1 介导的谷氨酸释放是异常紧张性兴奋的来源

该图聚焦钙激活氯通道 BEST1，明确其在 vmPFC 介导谷氨酸释放、引发异常紧张性兴奋的作用。蛋白检测显示，SNI 术后 28 天起 vmPFC 的 BEST1 表达显著上调，35-56 天持续高表达，且仅在对侧 vmPFC（与疼痛调控相关）变化明显；免疫荧光定位证实，vmPFC 的 BEST1 主要表达于兴奋性锥体细胞（CaMKIIα 阳性神经元），而非星形胶质细胞，为其释放谷氨酸提供了细胞基础；钙离子成像显示，SNI 术后 35 天 vmPFC 兴奋性神经元钙离子水平显著升高，可激活 BEST1 通道；通过 shRNA 敲低 BEST1 表达后，BEST1 通道的谷氨酸通透性、胞外谷氨酸浓度及异常紧张性兴奋电流均显著降低，直接证明vmPFC 兴奋性神经元的 BEST1 通道是慢性疼痛后期谷氨酸异常释放、引发紧张性兴奋的核心分子。

Figure 6：神经元 BEST1 敲除缓解 SNI 诱导的焦虑样行为

该图通过条件性基因敲除实验，验证 BEST1 作为焦虑干预靶点的有效性。对 Best1 基因 flox 小鼠，在 SNI 术后 14 天向对侧 vmPFC 注射 Cre 重组病毒，特异性敲除神经元 BEST1 后，BEST1 蛋白表达、谷氨酸通透性及异常紧张性兴奋均被完全抑制；电生理记录显示，BEST1 敲除可显著逆转 SNI 术后 35 天 AMPAR 突触传递的增强效应；行为学测试进一步证实，神经元 BEST1 敲除不影响小鼠机械性痛觉过敏，却能显著改善高架十字迷宫、新奇抑制摄食测试中的焦虑样行为，且该效应在雌雄小鼠中均成立，明确特异性抑制 vmPFC 神经元 BEST1，可在不缓解疼痛的前提下，有效治疗慢性神经病理性疼痛相关焦虑。

Figure 7：药物靶向 BEST1 可缓解 SNI 诱导的焦虑样行为

该图以阴离子通道阻滞剂 DIDS 为工具，验证 BEST1 作为药物干预靶点的可行性。体外实验确定 50μM DIDS 可有效抑制 BEST1 通道的氯离子通透性；体内实验中，对 SNI 术后 35 天小鼠 vmPFC 局部注射 DIDS，可显著缓解焦虑样行为且不影响疼痛阈值；进一步验证特异性，在 Best1 条件性敲除小鼠中，DIDS 的抗焦虑效应完全消失，证明 DIDS 的作用严格依赖 BEST1 表达；同时，该药物干预效应在另一种神经病理性疼痛模型（SNL）中得到重复，证实靶向 BEST1 的小分子药物可作为慢性疼痛相关焦虑的潜在治疗手段，且该干预策略具有普适性。

本研究阐明慢性神经病理性疼痛相关焦虑的双重机制：AMPAR 膜转运是基础，神经元 BEST1 介导的谷氨酸释放引发的异常紧张性兴奋是核心触发，后者进一步增强 AMPAR 突触传递，最终诱导焦虑样行为。神经元 BEST1 特异性调控焦虑，不影响慢性疼痛感知，且能改善镇痛治疗后残留的焦虑症状。靶向抑制 BEST1（基因或药物）可有效缓解疼痛合并焦虑，为临床治疗慢性疼痛相关焦虑提供了全新、特异性的干预靶点与策略。

局限：研究以雄性小鼠为主，雌性小鼠数据不全；仅用非特异性 BEST1 抑制剂 DIDS，缺乏高选择性药物；未验证谷氨酸浓度超阈值、无 AMPAR 转运时是否单独诱发焦虑。展望：补充雌性小鼠实验；开发高选择性 BEST1 小分子抑制剂；深入探究 BEST1 在其他疼痛模型相关焦虑中的普适性。