洛贝林在活体小鼠和实验室养的“迷你肿瘤”上的效果。他们在MC38小鼠身上试了不同剂量，发现洛贝林能明显减慢肿瘤长大的速度，而且剂量越高效果越棒。PCNA蛋白也随着剂量增加而减少了。人的结直肠癌类器官实验也证实了类似的抑制效果。总的来说，洛贝林抑制结直肠癌增殖的效果还是挺稳的（图1）。
图1 洛贝林可减少MC38异种移植C57BL/6小鼠和结直肠癌类器官的肿瘤负荷
复现建议：小鼠皮下接种MC38细胞，肿瘤长到100mm³时给药。洛贝林腹腔注射，试12.5、25、50mg/kg，每天一次。隔天量肿瘤大小，最后称瘤重。PCNA用免疫组化检测。类器官用不同浓度洛贝林处理，几天后评估活性。
单细胞测序的结果，就是想看洛贝林到底在肿瘤里动了哪些“手脚”。他们发现洛贝林组里癌细胞比例下降了，但免疫细胞比例上升了。具体来看，抗肿瘤的M1巨噬细胞、CD8+T细胞变多了，而促肿瘤的M2巨噬细胞变少了。通路分析也提示T细胞功能被激活了。洛贝林确实把坏的免疫环境往好的方向掰了掰（图2）。
图2 ScRNA-seq分析显示，罗布麻碱能够延缓小鼠移植结直肠癌的生长
复现建议：取肿瘤消化成单细胞悬液，送10x单细胞测序。数据用CellRanger和Seurat处理，质控：UMI<10万、基因<6500、线粒体基因<10%。用FindAllMarkers找差异基因，Monocle2做拟时序。比较两组各细胞亚群的比例和功能变化。
发现了洛贝林的一个关键“靶点基因”——Slurp1。通过单细胞测序的数据分析，他们看到洛贝林处理后Slurp1的mRNA水平明显上调了，而且这种上调主要发生在癌细胞里面。qPCR和Western blot进一步验证了，洛贝林剂量越高，Slurp1的mRNA和蛋白水平都跟着涨。免疫组化也直观地看到肿瘤里SLURP1蛋白变多了。所以结论就是：洛贝林能显著提升癌细胞中SLURP1的表达水平（图3）。
复现建议：小鼠给药后取肿瘤。一部分提RNA做qPCR；一部分提蛋白做Western blot，用SLURP1抗体。石蜡切片做免疫组化。有条件也可在体外直接处理MC38细胞，看洛贝林对SLURP1的影响。
洛贝林的抑瘤作用到底是不是通过SLURP1实现的？他们用CRISPR/Cas9技术敲掉了MC38细胞的Slurp1基因，然后种到小鼠身上。结果发现，在Slurp1敲除的肿瘤里，洛贝林几乎不起作用了——肿瘤的体积和重量跟没用药的差不多。而正常的MC38肿瘤里，洛贝林效果很明显。这就说明，洛贝林的抑瘤效果很大程度上要依赖于SLURP1的存在（图4）。
图4 Slurp1缺失逆转了洛贝林对肿瘤负荷的改善作用
复现建议：先用CRISPR构建Slurp1敲除MC38，Western blot验证。然后平行接种正常和敲除细胞。肿瘤长到100-150mm³时给洛贝林。比较四组的肿瘤生长曲线和瘤重，再用IHC检测SLURP1和PCNA。
前面发现的SLURP1和免疫细胞的变化给联系起来了。单细胞数据显示，洛贝林处理后M1巨噬细胞变多了、M2巨噬细胞变少了。M1相关的基因上调了，M2相关的基因下调了。拟时序分析进一步提示TAM有向M1方向极化的趋势。最关键的是，当敲掉癌细胞的Slurp1后，洛贝林对巨噬细胞的这种调控作用就被削弱了。这说明，是癌细胞分泌的SLURP1在“指挥”巨噬细胞的极化方向（图5）。
图5 结肠癌细胞衍生的SLURP1参与了洛贝林调节巨噬细胞极化的过程
复现建议：用流式分析肿瘤中巨噬细胞亚群。抗体选CD45、CD11b、F4/80加上CD86和CD206。比较PBS组和洛贝林组的比例。也可用Slurp1敲除肿瘤做平行对比。体外可收集洛贝林处理过的MC38上清，加到巨噬细胞体系中看能否诱导M1极化。
揭开了洛贝林的“直接靶点”的面纱。他们用了一种叫TRAP的技术筛选与洛贝林结合的蛋白质，结果从16个候选蛋白里锁定了MAPK14。等温滴定量热法确认了二者直接结合，亲和力达到16.6nM。分子对接预测了可能的结合位点，比如A34、R57、R67、R173等。把这些位点突变掉之后，结合能力几乎就丧失了。所以MAPK14确实是洛贝林在结直肠癌中的一个关键靶点（图6）。
复现建议：TRAP：细胞用30µM洛贝林处理，裂解后甲醛标记，酶解成肽段，LC-MS/MS检测。ITC需要纯化的MAPK14和洛贝林，25°C下用ITC200滴定。MST验证突变体：荧光标记的MAPK14与梯度稀释的洛贝林混合，用Monolith NT.115测Kd。
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