原发灶和肝转移灶的单细胞对比显示，转移灶癌细胞携带更多基因拷贝数变异，增殖快、适应缺氧的能力也更强。这解释了为什么肝转移更难治（图1）。
复现思路：
手头有配对的转移和非转移样本，可以送几个做单细胞测序。样本量不用大，但部位要配齐，这样对比才有意义。
通过功能模块打分，他们发现了一个高表达EMT相关基因的癌细胞亚群。这个亚群在将来会转移的患者原发灶里更多，可能是转移的“苗头”（图2）。
复现思路：
单细胞数据量大，光看差异基因容易漏东西。可以试试用基因集打分的方式，把细胞按功能状态分类，更容易找到“搞事情”的那一小群。
多组数据确认ENO2高表达的患者活得更短。小鼠身上敲掉ENO2，肿瘤长得慢，肝转移结节也少了超过一半，效果挺明显（图3）。
复现思路：
筛到关键分子后，用CRISPR敲除或慢病毒过表达，然后做皮下成瘤和脾脏注射肝转移实验。这两个模型相对成熟，数据也好解释。
细胞通讯分析发现ENO2阳性的癌细胞通过MIF通路和巨噬细胞聊得火热。免疫共沉淀和体外结合实验都证实ENO2和MIF直接绑在一起（图4）。
图4.ENO2通过与 MIF 直接相互作用
调控M2型巨噬细胞极化
复现思路：
想证明两个蛋白直接结合，先在细胞里做Co-IP，再在体外做纯化蛋白的结合实验。两者都做出来，基本就没跑了。
ENO2少了，MIF蛋白就少了；加上MG132阻断降解系统后，MIF又回来了。说明ENO2是通过抑制MIF被“吃掉”来稳定它的（图5）。
复现思路：
发现A蛋白能影响B蛋白的水平，不妨先加MG132看看B蛋白能不能恢复。如果能，再去做泛素化检测，这是判断是否涉及降解通路的直接证据。
空间转录组证实ENO2阳性的癌细胞和M2型巨噬细胞在组织中挨得很近。共培养实验也表明，高表达ENO2的癌细胞确实能把巨噬细胞往M2方向推（图6）。
图6.ENO2通过诱导M2型巨噬细胞极化促进肝转移
复现思路：
验证癌细胞对免疫细胞的影响，用Transwell做非接触共培养就行。收巨噬细胞跑流式，看M1/M2标志物。想确认因果关系，再补一个阻断抗体的挽救实验。
7、ENO2拉来HSP90，挡住CHIP的“剪刀”
ENO2把HSP90带到MIF身边，形成一个三方复合物，不让E3连接酶CHIP下手切MIF。具体来说，CHIP本来想切MIF的第66位赖氨酸，但被挡住了（图7）。
图7.ENO2招募HSP90以拮抗CHIP介导的 MIF 泛素化及降解过程
复现思路：
找到互作蛋白后，要问它有什么用。可以同时改变两个分子的表达水平（比如敲低A的同时过表达B），看对下游蛋白的影响，这是验证调控关系的常用套路。
用计算机从六千多个化合物里筛出吡硫醇，它能破坏ENO2和MIF的结合。小鼠吃了这个药，肝转移结节明显减少，而且肿瘤里的MIF信号通路也被压下去了（图8）。
图8.吡硫氧辛作为ENO2- MIF 相互作用抑制剂的鉴定与验证及其体内抗转移作用
复现思路：
有了明确的蛋白互作界面，可以试试虚拟筛选。筛出来的化合物先用Co-IP验证能不能拆散互作，有效的话再上动物模型评估疗效。
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