南京大学「国家杰青」,最新Nature Nanotechnology!

蛋白质是生命活动的核心执行者，其序列信息直接决定三维结构与生物学功能。然而，与核酸测序技术相比，蛋白质测序长期面临"读不长、读不准、读不全"的困境。传统的Edman降解法仅能读取肽链N端，且通量极低；质谱技术虽为主流手段，却在极短肽段、超长肽段及翻译后修饰的精准鉴定上存在固有盲区——尤其当多个碱性氨基酸聚集时，质子化效应会抑制肽键断裂，导致谱图解析失败。更棘手的是，蛋白质无法像DNA那样通过PCR扩增，低丰度蛋白的检测灵敏度始终受限。近年来，纳米孔技术凭借单分子灵敏度和无需标记的优势，被视为突破蛋白质测序瓶颈的潜在路径，但肽链过孔时的快速易位与空间位阻效应，使得分辨单个氨基酸及其相邻干扰成为巨大挑战。如何设计一种既能"抓住"肽段、又能"看清"序列的纳米孔传感策略，成为连接纳米孔技术与蛋白质组学应用的关键科学问题。

针对上述瓶颈，南京大学黄硕团队开发了一种镍离子修饰的MspA纳米孔（MspA-NTA-Ni），利用肽链N端与孔道内镍离子的配位相互作用，将肽段"锚定"在传感区域，从而显著降低热运动噪声、提升分辨能力。该策略无需对肽段进行化学标记或强制易位，即可同时识别20种天然氨基酸、多种翻译后修饰及长度达39个氨基酸的肽段。研究团队进一步构建了"水解-传感-组装"的测序流程：通过外肽酶水解获取氨基酸组成信息以精简数据库，再利用胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶产生具有序列重叠的肽段片段，结合机器学习算法对片段特征进行解析与拼接，最终实现了14个氨基酸参考肽段的完整序列重构。该方法不仅能精准识别单氨基酸突变（包括质谱难以区分的亮氨酸/异亮氨酸替换）和磷酸化、乙酰化等修饰，还能对血管紧张素、胰高血糖素等生物活性肽及肿瘤新抗原进行直接检测，为单分子蛋白质组学分析提供了兼具高分辨率与广谱适用性的新工具。

图1 | MspA-NTA-Ni纳米孔可为多种合成肽建立事件数据库，并通过机器学习实现混合肽段自动识别。

图2 | 酶解生成的肽段混合物可形成特异纳米孔指纹谱，用于生物活性肽轮廓识别。

图3 | 外肽酶与内肽酶产生互补片段，结合纳米孔事件数据库可实现参考肽序列组装。

图4 | 基于水解片段的纳米孔序列组装能够识别单氨基酸突变、异亮氨酸/亮氨酸替换和末端缺失。

图5 | 扩展含磷酸化和乙酰化片段的数据库后，MspA-NTA-Ni可定位肽段翻译后修饰。

Wang, K., An, X., Gao, X. et al. High-resolution nanopore peptide sensing, profiling and sequence assembly. Nat. Nanotechnol. (2026).

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